銀杏內(nèi)酯B及黃芪皂甙促進小鼠神經(jīng)干細胞分化的實驗研究.pdf

1、一、研究背景： 脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)是指由于各種外力作用于脊柱所造成的脊髓壓迫或斷裂，多系車禍、墜落傷等造成脊柱脫位、骨折所致。脊髓是感覺、運動和植物神經(jīng)系統(tǒng)的傳導(dǎo)通路，因此損傷的主要癥狀是由于傳導(dǎo)通路的中斷而引起的麻痹，主要表現(xiàn)為損傷平面以下運動、感覺和自主神經(jīng)功能的障礙。SCI所致癱瘓給患者本人、家庭和社會帶來沉重的負擔(dān)和嚴重的社會問題。隨著科學(xué)研究的進展，神經(jīng)干細胞移植從促進損傷脊髓再生

2、與修復(fù)的目的出發(fā)，為SCI的治療帶來了新的希望。 神經(jīng)干細胞(neural stem cells，NSCs)是能主要分化為神經(jīng)細胞的一種干細胞，廣泛存在于神經(jīng)系統(tǒng)，研究顯示成年嗅球、皮層、室管膜層和室管膜下層、紋狀體、海馬齒狀回顆粒細胞下層等腦組織中都分布著神經(jīng)干細胞。神經(jīng)干細胞終身具有自我更新能力和多向分化潛能，在一定條件下能分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞。神經(jīng)干細胞不僅能促進神經(jīng)元的再生和腦組織的修復(fù)，而且通過基因

3、修飾還可用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的基因治療，為許多難以治療的神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供了新的治療途徑。神經(jīng)干細胞在體內(nèi)外的分化受到多種因素的影響，其最終分化結(jié)果與其所處的微環(huán)境是密切相關(guān)的。神經(jīng)干細胞的移植為中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療帶來了新的希望，但移植治療的關(guān)鍵問題是誘導(dǎo)神經(jīng)干細胞定向分化所需的神經(jīng)元，因此探求誘導(dǎo)神經(jīng)干細胞定向分化的最佳微環(huán)境成為研究的熱點。國內(nèi)外研究表明，中藥不僅可以保護神經(jīng)細胞，提高神經(jīng)元抵抗損傷的能力，而且能促進NSCs的增殖并誘

4、導(dǎo)其定向分化為功能性神經(jīng)元，達到治療神經(jīng)功能缺損疾病的目的。因此，研究中藥對NSCs的增殖、分化及抗損傷的機制，對利用中藥開發(fā)神經(jīng)干細胞在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的應(yīng)用具有重要意義。 近年來中藥單體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能損害性疾病的治療方面顯示了獨特的療效。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)銀杏葉提取物銀杏內(nèi)酯B(Ginkgolide B，GKB)對神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元分化有促進作用。進一步研究發(fā)現(xiàn)，銀杏內(nèi)酯B還具有類似BDNF誘導(dǎo)神經(jīng)干細胞分化為神經(jīng)元的作用。黃芪皂甙

5、( Saponins of Astragalus，SA)為黃芪的主要成分，研究表明黃芪注射液誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的NSCs向神經(jīng)元的分化有積極作用，但是單體黃芪皂甙對神經(jīng)干細胞分化的作用未見相關(guān)報道。進一步闡明銀杏內(nèi)酯B及黃芪皂甙在神經(jīng)干細胞分化的作用及機制，以及在神經(jīng)干細胞修復(fù)脊髓損傷中的作用對神經(jīng)修復(fù)領(lǐng)域具有重要價值。GFP轉(zhuǎn)基因小鼠具有遺傳穩(wěn)定、全身細胞均表達綠色熒光蛋白，從其體內(nèi)分離出的細胞不因細胞分裂降低綠色熒光表達強度，較好地解決細

6、胞標記的問題，非常便于活細胞在生物體內(nèi)生物學(xué)行為的觀察，因而在細胞及基因治療的研究中有較高的應(yīng)用價值。 二、目的： 通過體外培養(yǎng)昆明小鼠胎鼠神經(jīng)干細胞，采用免疫熒光細胞化學(xué)方法比較銀杏內(nèi)酯B及黃芪皂甙對神經(jīng)干細胞分化的影響；體內(nèi)移植GFP轉(zhuǎn)基因小鼠神經(jīng)干細胞進入小鼠脊髓損傷部位，采用行為學(xué)和形態(tài)學(xué)方法觀察移植到體內(nèi)的神經(jīng)干細胞在修復(fù)脊髓損傷中的作用。為探討中藥促進神經(jīng)干細胞分化而治療脊髓損傷的研究提供基礎(chǔ)。 三、

7、方法： 1.從昆明小鼠胎鼠中分離和培養(yǎng)NSCs，在加入40mg/L銀杏內(nèi)酯B和20mg/L、40mg/L、60mg/L黃芪皂甙的分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h、3d和7d，用倒置相差顯微鏡測量分化細胞神經(jīng)突起長度：用免疫熒光細胞化學(xué)染色方法檢測其微管相關(guān)蛋白(β-Tubulin)、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)及少突膠質(zhì)細胞特異性蛋白(CC-1)的表達，并計算陽性細胞的百分率；比較銀杏內(nèi)酯B和黃芪皂甙對神經(jīng)干細胞的分化作用。 2.

8、將GFP轉(zhuǎn)基因小鼠NSCs移植入小鼠脊髓全橫斷處，用形態(tài)學(xué)方法觀察移植細胞在體內(nèi)的分化情況，并用行為學(xué)方法檢測脊髓功能的恢復(fù)情況，探討NSCs移植在SCI恢復(fù)中所起的作用。在體實驗分為三組：A.對照組：動物只施行切皮、打開椎管，不施行SCI； B.手術(shù)對照組：T11節(jié)段脊髓全橫斷損傷；C. NSCs移植組：在T11節(jié)段脊髓完全橫斷后立即用微量注射器將GFP神經(jīng)干細胞注入橫斷部位。通過免疫組織化學(xué)觀察移植神經(jīng)干細胞在脊髓內(nèi)的存活和分化，通

9、過對各組小鼠進行后肢BBB運動功能評分觀察小鼠脊髓功能恢復(fù)情況。 四、結(jié)果： 1.從昆明小鼠胎鼠中成功分離和培養(yǎng)NSCs，Nestin染色陽性。 2.銀杏內(nèi)酯B組分化(1d、3d)突起長度相比對照組突起長度有顯著增長(P<0.05)。20mg/L、40mg/L、60mg/L黃芪皂甙組突起長度相比對照組突起長度均有顯著增長(P<0.05)。銀杏內(nèi)酯B組突起長度比黃芪皂甙各組的突起長度均更長，具有顯著性差異(P<0.

10、05)，20mg/L、40mg/L、60mg/L黃芪皂甙組神經(jīng)突起的平均長度三組間比較無顯著差異(P>0.05)。 3.銀杏內(nèi)酯B組分化(3d、7d)后，β-Tubulin陽性神經(jīng)元百分率、GFAP陽性星形膠質(zhì)細胞百分率均顯著高于對照組(P<0.01)，CC-1陽性少突膠質(zhì)細胞百分率無明顯變化。20mg/L黃芪皂甙組分化為p-Tubulin陽性神經(jīng)元百分率與對照組相比無顯著性差異(P>0.05)，40mg/L和60mg/L黃芪皂

11、甙組分化為β-Tubulin神經(jīng)元的百分率與對照組相比顯著增高(P<0.01)，40mg/L和60mg/L黃芪皂甙組分化為β-Tubulin神經(jīng)元的百分率與20mg/L黃芪皂甙組相比顯著增高(P<0.01)，兩種濃度組間無顯著性差異(P>0.05)。20mg/L、40mg/L和60mg/L黃芪皂甙的三個濃度組分化為GFAP陽性星形膠質(zhì)細胞百分率與對照組相比均無顯著性差異(P>0.05)，黃芪皂甙的三個濃度組間無顯著性變化(P>0.05)

12、。20mg/L、40mg/L和60mg/L黃芪皂甙的三個濃度組分化為少突膠質(zhì)細胞百分率與對照組相比均無明顯影響，黃芪皂甙的三個濃度組間無顯著性變化(P>0.05)。 4.在體研究發(fā)現(xiàn)，移植的NSCs不僅能夠存活，而且NSCs移植治療小鼠脊髓損傷后，能夠分化為神經(jīng)元，提示其對損傷脊髓的結(jié)構(gòu)具有一定的修復(fù)作用。 5.通過后肢BBB運動評分，觀察到NSCs移植SCI小鼠脊髓后，對后肢整體運動功能修復(fù)具有明顯的促進作用。

13、 五、結(jié)論： 1.銀杏內(nèi)酯B和黃芪皂甙均能促進突起的生長，但以銀杏內(nèi)酯B的作用更明顯；銀杏內(nèi)酯B和黃芪皂甙均能促進NSCs向神經(jīng)元分化，其中黃芪皂甙能促進NSCs向神經(jīng)元定向分化，而銀杏內(nèi)酯B同時又促進了NSCs向星形膠質(zhì)細胞的分化，兩種中藥對分化為CC-1陽性少突膠質(zhì)細胞的百分率無顯著影響。上述結(jié)果為進一步聯(lián)合應(yīng)用銀杏內(nèi)酯B(更好地促進突起生長作用)和黃芪皂甙(促進神經(jīng)元定向分化)治療脊髓損傷提供了可能性。 2.通過體