Atg7對小鼠神經(jīng)干細(xì)胞增殖及分化能力的影響.pdf

1、目的：探究自噬相關(guān)基因Atg7對NSCs增殖及分化潛能的影響，旨在尋找影響NSCs增殖活力及分化能力的關(guān)鍵靶點，為治療神經(jīng)退行性疾病提供新的可行性策略。
　　方法：⑴設(shè)計合成靶向Atg7的siRNA序列及其對照siRNA，電穿孔法分別轉(zhuǎn)染NSCs，轉(zhuǎn)染48h后提取NSCs總的RNA，72h后提取NSCs全蛋白，運用Real-time PCR及Western blot分別從mRNA水平和蛋白水平測定Atg7基因的敲減效率。⑵應(yīng)用We

2、stern blot比較siRNA組與對照組siRNA的LC3II以及P62的表達(dá)變化，檢測敲減Atg7對NSCs自噬水平的影響。⑶測量神經(jīng)球的數(shù)量和平均直徑，運用溴脫氧尿嘧啶核苷（BrdU）摻入實驗檢測Atg7基因沉默對NSCs增殖能力的影響。⑷利用Tuj1和GFAP免疫熒光染色分析Atg7基因敲減對NSCs分化能力的影響。⑸應(yīng)用SA-β-gal染色檢測siRNA組與對照組siRNA衰老細(xì)胞陽性率，qPCR分析P16、P21、P27和

3、P53衰老相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄情況。
　　結(jié)果：①RT-PCR結(jié)果顯示 siRNA組 Atg7 mRNA水平亦較對照組顯著降低54％（P<0.001），但Atg3，Atg5，Beclin1自噬其他相關(guān)基因的mRNA水平無顯著變化；Western blot顯示， Atg7敲減組的蛋白表達(dá)水平較對照組降低35%（P<0.01），提示siRNA干擾能夠顯著降低NSCs Atg7的表達(dá)水平。②Western blot結(jié)果顯示， siRNA組LC

4、3II蛋白水平較對照組降低27.5%（P<0.05），P62蛋白水平為對照組的1.5倍（P<0.001），提示敲減Atg7基因后，能夠降低NSCs的自噬水平。③siRNA組神經(jīng)球的數(shù)目較對照組降低20%（P<0.01）而且平均直徑下降30%（P<0.01）；BrdU免疫熒光染色實驗結(jié)果顯示siRNA組BrdU陽性率較對照組顯著下降29.8%（P<0.001），提示Atg7基因敲減可以抑制NSCs的增殖的能力。④Tuj1和GFAP免疫熒光

5、染色顯示，Atg7-siRNA實驗組Tuj1陽性細(xì)胞率較對照組顯著降低38.3%（P<0.05），而其GFAP陽性細(xì)胞率為對照組的1.8倍（P<0.01）。提示Atg7基因沉默可以抑制NSCs向神經(jīng)元方向分化的能力。⑤SA-β-gal染色結(jié)果顯示siRNA組中衰老陽性細(xì)胞數(shù)是對照組的2.8倍（P<0.001），P16、P21、P53的mRNA表達(dá)水平分別為對照組的1.5（P<0.05）、1.6（P<0.05）、1.6（P<0.001）倍