天麻及小分子RNA對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化的影響.pdf

1、第一部分、天麻對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的影響
　　天麻（Gastrodia elata）是可以用于保健食品的藥材，在我國(guó)被廣泛的栽培與使用。我國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，天麻含酚類、多糖類、甾醇類和有機(jī)酸類等多種活性成分，因而具有抗驚厥、鎮(zhèn)痛、降壓、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞、延緩衰老、增強(qiáng)免疫、抗氧化等作用。
　　本文通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)采用天麻預(yù)先處理小鼠神經(jīng)干細(xì)胞能夠緩解細(xì)胞因CoCl2缺氧而導(dǎo)致的細(xì)胞增殖能力的下降。神經(jīng)細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間的缺氧會(huì)引起神

2、經(jīng)細(xì)胞的凋亡、結(jié)構(gòu)發(fā)生改變和神經(jīng)系統(tǒng)的功能減退，進(jìn)一步可能引起癲癇、阿爾茨海默癥以及帕金森等多種神經(jīng)性疾病。本研究結(jié)果表明：長(zhǎng)期適量的服用天麻能夠起到降低患阿爾茲海默癥和帕金森等退行性神經(jīng)疾病的可能性。
　　為了進(jìn)一步研究天麻對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞作用的分子機(jī)制，我們采用RNA-Seq高通量測(cè)序技術(shù)分析了天麻作用前后神經(jīng)干細(xì)胞的表達(dá)譜，并通過(guò)WGCNA方法獲得了基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)。在對(duì)胚胎神經(jīng)干細(xì)胞的研究中，共獲得26個(gè)共表達(dá)模塊，它們都與天麻

3、呈現(xiàn)一定的正負(fù)相關(guān)性。我們選取了其中4個(gè)模塊進(jìn)行了KEGG功能富集分析，在與天麻顯著正相關(guān)模塊salmon2中發(fā)現(xiàn)了包括錯(cuò)配堿基修復(fù)（Mismatch repair）、同源重組（Homologous recombination）、核酸切除修復(fù)（Nucleotide excision repair）、堿基切除修復(fù)（Base excision repair）以及非同源末端連接（Non-homologous end-joining）在內(nèi)的多個(gè)

4、與DNA損傷修復(fù)相關(guān)的通路，表明天麻能夠激活DNA損傷修復(fù)相關(guān)基因的表達(dá)。而與天麻顯著負(fù)相關(guān)的模塊green中發(fā)現(xiàn)了凋亡Apoptosis通路。除此之外，根據(jù)模塊分析，天麻也和DNA的復(fù)制（DNA replication）、細(xì)胞周期（Cell cycle）、蛋白質(zhì)的生物合成（Ribosome biogenesis in eukaryotes，Aminoacyl-tRNA biosynthesis）、堿基的生物合成（Pyrimidine

5、metabolism和Purine metabolism）等與細(xì)胞增殖相關(guān)的通路呈正相關(guān)；和幾個(gè)疾病相關(guān)的通路，如Parkinson's disease、Alzheimer's disease、Huntington's disease呈負(fù)相關(guān)。這些結(jié)果表明：細(xì)胞在缺氧的逆境中DNA損傷嚴(yán)重，這種損傷如果不能得到修復(fù)就會(huì)引起細(xì)胞的凋亡，加入天麻后細(xì)胞之所以能夠緩解因CoCl2缺氧而導(dǎo)致的細(xì)胞增殖能力的下降，其根本原因就在于DNA損傷修復(fù)能

6、力加強(qiáng)，凋亡細(xì)胞減少。
　　生物信息學(xué)分析顯示：天麻正相關(guān)salmon2模塊中存在與DNA修復(fù)以及周期相關(guān)的基因，如POLD1基因、MCM5基因和ANAPC5基因。POLD1基因編碼DNA聚合酶δ的C末端亞基，具3'-5'外切酶活性，是DNA復(fù)制和修復(fù)過(guò)程中起關(guān)鍵作用基因；MCM5基因編碼的蛋白是與DNA復(fù)制有密切關(guān)系的蛋白，該蛋白只在處于增殖活動(dòng)周期的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，決定細(xì)胞由G0期向G1/S期轉(zhuǎn)變，是增殖細(xì)胞的特殊標(biāo)志物；ANAP

7、C5基因產(chǎn)物參與控制細(xì)胞有絲分裂和細(xì)胞周期G1期的進(jìn)程。天麻負(fù)相關(guān)green模塊中存在細(xì)胞凋亡中非常重要的基因——TNFRSF10B和MAPKAPK3。TNFRSF10B基因編碼的蛋白定位于細(xì)胞膜，招募FADD、CASP8等形成死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合體(DISC)，啟動(dòng)CASP級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。而MAPKAPK3基因產(chǎn)物是MAPK信號(hào)通路蛋白，而該信號(hào)通路參與細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)節(jié)。
　　本研究從細(xì)胞水平和分子水平闡明了天麻通過(guò)激活

8、神經(jīng)干細(xì)胞的DNA損傷修復(fù)相關(guān)基因的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞凋亡的機(jī)制。研究結(jié)果為天麻作為保健食品的研究、開(kāi)發(fā)及生產(chǎn)提供理論依據(jù)。
　　第二部分、小分子RNA對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化的影響——microRNAs抑制脆性X綜合征基因FMR1的表達(dá)及調(diào)節(jié)小鼠胚胎神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化
　　最常見(jiàn)的遺傳性智力低下疾病——脆性X綜合征（Fragile X syndrome，F(xiàn)XS）是由于存在于X-連鎖的脆性X智力低下基因1（Fragile X

9、 mental retardation1，F(xiàn)MR1）的5′非翻譯區(qū)域（5′untranslated region，5′-UTR）的CGG三核苷酸重復(fù)產(chǎn)生了異常擴(kuò)增，而最終導(dǎo)致脆性X智力低下蛋白（Fragile X Mental Retardation Protein，F(xiàn)MRP)表達(dá)的轉(zhuǎn)錄沉默或減少。在人群中，CGG三核苷酸重復(fù)具有高度的多態(tài)性，正常人的重復(fù)數(shù)介于6-54之間，并可以在子代穩(wěn)定的遺傳；當(dāng)重復(fù)數(shù)擴(kuò)展至55-200之間時(shí)，被稱

10、為“前突變”，“前突變”極其不穩(wěn)定，可以在母嬰傳播過(guò)程中演變成全突變；當(dāng)重復(fù)數(shù)超過(guò)200時(shí)，被稱為全突變，全突變患者在CGG三核苷酸重復(fù)、CpG島以及鄰近的基因序列上發(fā)生過(guò)度甲基化，導(dǎo)致FMR1基因轉(zhuǎn)錄沉默，不能翻譯產(chǎn)生FMRP。
　　FMRP是一種在進(jìn)化上保守的選擇性的RNA結(jié)合蛋白。在腦組織中，F(xiàn)MRP可選擇性的與含自身mRNA在內(nèi)的超過(guò)4％的信使RNA結(jié)合，從而抑制它們的表達(dá)。FMRP在哺乳動(dòng)物的腦、血液、睪丸、脾和肝組織中

11、都有分布，尤其在神經(jīng)元細(xì)胞中高表達(dá)。多項(xiàng)研究表明，F(xiàn)MRP在調(diào)節(jié)mRNA翻譯、運(yùn)輸和穩(wěn)定等方面起著至關(guān)重要的作用。在神經(jīng)元細(xì)胞中，F(xiàn)MRP對(duì)與之結(jié)合的mRNA的轉(zhuǎn)錄及翻譯后修飾進(jìn)行調(diào)節(jié)，影響下游蛋白的表達(dá)；在細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核之間穿梭的FMRP改變mRNA的亞細(xì)胞定位；神經(jīng)發(fā)生和突觸的可塑性也受其影響。小鼠的體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)顯示，從成體神經(jīng)干細(xì)胞中敲除FMRP會(huì)導(dǎo)致海馬神經(jīng)元的降低，并顯著地影響海馬依賴的學(xué)習(xí)記憶。此外，F(xiàn)MRP的缺失會(huì)促進(jìn)成

12、體神經(jīng)干細(xì)胞的增殖而改變其分化命運(yùn)。
　　microRNA（miRNA）是一類平均長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的，由內(nèi)源基因編碼的單鏈非編碼RNA。目前已證實(shí)，miRNA廣泛存在于真核生物細(xì)胞中，通過(guò)對(duì)靶分子mRNA的轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控，在生物個(gè)體器官的形態(tài)建成、細(xì)胞增殖與分化、細(xì)胞周期、凋亡、個(gè)體發(fā)育、成體干細(xì)胞以及胚胎干細(xì)胞的發(fā)育進(jìn)程等一系列重要的生命活動(dòng)中進(jìn)行調(diào)節(jié)。在目前發(fā)現(xiàn)的microRNA中，有70%在哺乳動(dòng)物的腦中存在，提示mi

13、croRNA在神經(jīng)系統(tǒng)及神經(jīng)疾病的發(fā)生中有著極其重要的作用。
　　本研究采用生物信息學(xué)的方法預(yù)測(cè)以小鼠FMR1基因作為靶標(biāo)的miRNA，發(fā)現(xiàn)用三個(gè)在線靶基因預(yù)測(cè)軟件（TargetScan Mouse，miRanda，miRDB）預(yù)測(cè)到500個(gè)miRNA可以靶向FMR1的3' UTR區(qū)，其中用2個(gè)軟件預(yù)測(cè)到的miRNA有164個(gè)，用3個(gè)軟件共同預(yù)測(cè)到的miRNA有61個(gè)。在這61個(gè)備選miRNA中，有18個(gè)在腦組織中高度表達(dá)。雙熒光

14、素酶報(bào)告分析（Luciferase reporter assay）顯示，與對(duì)照組相比，其中mmu-miR-19a、mmu-miR-23a、mmu-miR-25、mmu-miR-32、mmu-miR-92a、mmu-miR-124、mmu-miR-130b、mmu-miR-301、mmu-miR-325、mmu-miR-335、mmu-miR-350和mmu-miR-367可以顯著降低含有FMR13' UTR的報(bào)告基因載體的熒光素酶的活性

15、，提示FMR1可能為這些micoRNA的靶基因。
　　采用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體在小鼠胚胎神經(jīng)干細(xì)胞中過(guò)表達(dá)和表達(dá)下調(diào)miRNA，然后通過(guò)qRT-PCR和Western blot等實(shí)驗(yàn)觀察FMR1基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)mmu-miR-124和mmu-miR-130b能夠在mRNA水平和蛋白水平抑制FMR1基因的表達(dá)。
　　免疫組化分析顯示：mmu-miR-124和mmu-miR-130b通過(guò)抑制FMR1基因的表達(dá)，從而促進(jìn)小鼠神經(jīng)干細(xì)胞增