天麻及小分子RNA對神經干細胞增殖分化的影響.pdf

1、第一部分、天麻對神經干細胞的影響
　　天麻（Gastrodia elata）是可以用于保健食品的藥材，在我國被廣泛的栽培與使用。我國現(xiàn)代醫(yī)學研究表明，天麻含酚類、多糖類、甾醇類和有機酸類等多種活性成分，因而具有抗驚厥、鎮(zhèn)痛、降壓、保護神經細胞、延緩衰老、增強免疫、抗氧化等作用。
　　本文通過免疫細胞化學研究，發(fā)現(xiàn)采用天麻預先處理小鼠神經干細胞能夠緩解細胞因CoCl2缺氧而導致的細胞增殖能力的下降。神經細胞長時間的缺氧會引起神

2、經細胞的凋亡、結構發(fā)生改變和神經系統(tǒng)的功能減退，進一步可能引起癲癇、阿爾茨海默癥以及帕金森等多種神經性疾病。本研究結果表明：長期適量的服用天麻能夠起到降低患阿爾茲海默癥和帕金森等退行性神經疾病的可能性。
　　為了進一步研究天麻對神經干細胞作用的分子機制，我們采用RNA-Seq高通量測序技術分析了天麻作用前后神經干細胞的表達譜，并通過WGCNA方法獲得了基因共表達網絡。在對胚胎神經干細胞的研究中，共獲得26個共表達模塊，它們都與天麻

3、呈現(xiàn)一定的正負相關性。我們選取了其中4個模塊進行了KEGG功能富集分析，在與天麻顯著正相關模塊salmon2中發(fā)現(xiàn)了包括錯配堿基修復（Mismatch repair）、同源重組（Homologous recombination）、核酸切除修復（Nucleotide excision repair）、堿基切除修復（Base excision repair）以及非同源末端連接（Non-homologous end-joining）在內的多個

4、與DNA損傷修復相關的通路，表明天麻能夠激活DNA損傷修復相關基因的表達。而與天麻顯著負相關的模塊green中發(fā)現(xiàn)了凋亡Apoptosis通路。除此之外，根據模塊分析，天麻也和DNA的復制（DNA replication）、細胞周期（Cell cycle）、蛋白質的生物合成（Ribosome biogenesis in eukaryotes，Aminoacyl-tRNA biosynthesis）、堿基的生物合成（Pyrimidine

5、metabolism和Purine metabolism）等與細胞增殖相關的通路呈正相關；和幾個疾病相關的通路，如Parkinson's disease、Alzheimer's disease、Huntington's disease呈負相關。這些結果表明：細胞在缺氧的逆境中DNA損傷嚴重，這種損傷如果不能得到修復就會引起細胞的凋亡，加入天麻后細胞之所以能夠緩解因CoCl2缺氧而導致的細胞增殖能力的下降，其根本原因就在于DNA損傷修復能

6、力加強，凋亡細胞減少。
　　生物信息學分析顯示：天麻正相關salmon2模塊中存在與DNA修復以及周期相關的基因，如POLD1基因、MCM5基因和ANAPC5基因。POLD1基因編碼DNA聚合酶δ的C末端亞基，具3'-5'外切酶活性，是DNA復制和修復過程中起關鍵作用基因；MCM5基因編碼的蛋白是與DNA復制有密切關系的蛋白，該蛋白只在處于增殖活動周期的細胞內表達，決定細胞由G0期向G1/S期轉變，是增殖細胞的特殊標志物；ANAP

7、C5基因產物參與控制細胞有絲分裂和細胞周期G1期的進程。天麻負相關green模塊中存在細胞凋亡中非常重要的基因——TNFRSF10B和MAPKAPK3。TNFRSF10B基因編碼的蛋白定位于細胞膜，招募FADD、CASP8等形成死亡誘導信號復合體(DISC)，啟動CASP級聯(lián)反應，誘導細胞凋亡。而MAPKAPK3基因產物是MAPK信號通路蛋白，而該信號通路參與細胞增殖和凋亡的調節(jié)。
　　本研究從細胞水平和分子水平闡明了天麻通過激活

8、神經干細胞的DNA損傷修復相關基因的表達，從而抑制細胞凋亡的機制。研究結果為天麻作為保健食品的研究、開發(fā)及生產提供理論依據。
　　第二部分、小分子RNA對神經干細胞增殖分化的影響——microRNAs抑制脆性X綜合征基因FMR1的表達及調節(jié)小鼠胚胎神經干細胞的增殖和分化
　　最常見的遺傳性智力低下疾病——脆性X綜合征（Fragile X syndrome，F(xiàn)XS）是由于存在于X-連鎖的脆性X智力低下基因1（Fragile X

9、 mental retardation1，F(xiàn)MR1）的5′非翻譯區(qū)域（5′untranslated region，5′-UTR）的CGG三核苷酸重復產生了異常擴增，而最終導致脆性X智力低下蛋白（Fragile X Mental Retardation Protein，F(xiàn)MRP)表達的轉錄沉默或減少。在人群中，CGG三核苷酸重復具有高度的多態(tài)性，正常人的重復數介于6-54之間，并可以在子代穩(wěn)定的遺傳；當重復數擴展至55-200之間時，被稱

10、為“前突變”，“前突變”極其不穩(wěn)定，可以在母嬰傳播過程中演變成全突變；當重復數超過200時，被稱為全突變，全突變患者在CGG三核苷酸重復、CpG島以及鄰近的基因序列上發(fā)生過度甲基化，導致FMR1基因轉錄沉默，不能翻譯產生FMRP。
　　FMRP是一種在進化上保守的選擇性的RNA結合蛋白。在腦組織中，F(xiàn)MRP可選擇性的與含自身mRNA在內的超過4％的信使RNA結合，從而抑制它們的表達。FMRP在哺乳動物的腦、血液、睪丸、脾和肝組織中

11、都有分布，尤其在神經元細胞中高表達。多項研究表明，F(xiàn)MRP在調節(jié)mRNA翻譯、運輸和穩(wěn)定等方面起著至關重要的作用。在神經元細胞中，F(xiàn)MRP對與之結合的mRNA的轉錄及翻譯后修飾進行調節(jié)，影響下游蛋白的表達；在細胞質與細胞核之間穿梭的FMRP改變mRNA的亞細胞定位；神經發(fā)生和突觸的可塑性也受其影響。小鼠的體內和體外實驗顯示，從成體神經干細胞中敲除FMRP會導致海馬神經元的降低，并顯著地影響海馬依賴的學習記憶。此外，F(xiàn)MRP的缺失會促進成

12、體神經干細胞的增殖而改變其分化命運。
　　microRNA（miRNA）是一類平均長度約為22個核苷酸的，由內源基因編碼的單鏈非編碼RNA。目前已證實，miRNA廣泛存在于真核生物細胞中，通過對靶分子mRNA的轉錄后水平的調控，在生物個體器官的形態(tài)建成、細胞增殖與分化、細胞周期、凋亡、個體發(fā)育、成體干細胞以及胚胎干細胞的發(fā)育進程等一系列重要的生命活動中進行調節(jié)。在目前發(fā)現(xiàn)的microRNA中，有70%在哺乳動物的腦中存在，提示mi

13、croRNA在神經系統(tǒng)及神經疾病的發(fā)生中有著極其重要的作用。
　　本研究采用生物信息學的方法預測以小鼠FMR1基因作為靶標的miRNA，發(fā)現(xiàn)用三個在線靶基因預測軟件（TargetScan Mouse，miRanda，miRDB）預測到500個miRNA可以靶向FMR1的3' UTR區(qū)，其中用2個軟件預測到的miRNA有164個，用3個軟件共同預測到的miRNA有61個。在這61個備選miRNA中，有18個在腦組織中高度表達。雙熒光

14、素酶報告分析（Luciferase reporter assay）顯示，與對照組相比，其中mmu-miR-19a、mmu-miR-23a、mmu-miR-25、mmu-miR-32、mmu-miR-92a、mmu-miR-124、mmu-miR-130b、mmu-miR-301、mmu-miR-325、mmu-miR-335、mmu-miR-350和mmu-miR-367可以顯著降低含有FMR13' UTR的報告基因載體的熒光素酶的活性

15、，提示FMR1可能為這些micoRNA的靶基因。
　　采用逆轉錄病毒載體在小鼠胚胎神經干細胞中過表達和表達下調miRNA，然后通過qRT-PCR和Western blot等實驗觀察FMR1基因的表達，發(fā)現(xiàn)mmu-miR-124和mmu-miR-130b能夠在mRNA水平和蛋白水平抑制FMR1基因的表達。
　　免疫組化分析顯示：mmu-miR-124和mmu-miR-130b通過抑制FMR1基因的表達，從而促進小鼠神經干細胞增