BMP4對(duì)SVZa神經(jīng)干細(xì)胞增殖和分化的調(diào)控.pdf

1、本文在使用不同濃度BMP4細(xì)胞因子及其拮抗劑-Noggin誘導(dǎo)SVZa神經(jīng)干細(xì)胞增殖、分化的基礎(chǔ)上，利用啟動(dòng)子活體熒光標(biāo)記技術(shù)，動(dòng)態(tài)地顯示BMP4在SVZa、RMS和OB(Olfactorybulb，OB)神經(jīng)干細(xì)胞和祖細(xì)胞分化過(guò)程中的表達(dá)，同時(shí)使用Nestin增強(qiáng)子、酪氨酸羥化酶(Tyrosinehydroxylase，TH)和GFAP啟動(dòng)子活體標(biāo)記動(dòng)態(tài)地顯示SVZa神經(jīng)干細(xì)胞的分化過(guò)程，結(jié)合原位雜交結(jié)果，探討B(tài)MP4在SVZa神經(jīng)干

2、細(xì)胞增殖和分化過(guò)程中的作用。同時(shí)通過(guò)Mash1啟動(dòng)子活性分析探討B(tài)MP4與Mash1轉(zhuǎn)錄因子的關(guān)系。主要結(jié)果如下： 1.原位雜交顯示BMP4mRNA在新生小鼠的表達(dá)在SVZa到嗅球的遷移通路上，BMP4mRNA高表達(dá)于嗅球的周邊細(xì)胞，而在嗅球的中心區(qū)表達(dá)較低。在SVZa區(qū)域，BMP4mRNA為中等量表達(dá)，細(xì)胞呈散在分布，在包繞SVZa的星形膠質(zhì)細(xì)胞鞘中表達(dá)增高。在RMS中，BMP4mRNA的表達(dá)較為低下，僅見(jiàn)到極個(gè)別陽(yáng)性細(xì)胞。此

3、外，BMP4mRNA在與SVZa相鄰的SVZp具有相當(dāng)高的的表達(dá)。以上結(jié)果提示BMP4在SVZa神經(jīng)干細(xì)胞發(fā)育不同部位發(fā)揮不同的生理作用。 2.BMP4啟動(dòng)子活性分析SVZa神經(jīng)干細(xì)胞轉(zhuǎn)染pDsRed-Bmp4pro質(zhì)粒，貼壁分化12小時(shí)后見(jiàn)到極少量紅色熒光細(xì)胞。24-48小時(shí)后SVZ神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)孔中陽(yáng)性細(xì)胞明顯增多，熒光蛋白表達(dá)高峰期在48小時(shí)，48小時(shí)后減弱，5天后基本消失，早期(48小時(shí)內(nèi))紅色熒光蛋白主要表達(dá)于神經(jīng)元細(xì)

4、胞，晚期則主要表達(dá)于星形膠質(zhì)細(xì)胞。 SVZa、RMS和OB祖細(xì)胞分化過(guò)程中的熒光蛋白表達(dá)過(guò)程與SVZa神經(jīng)干細(xì)胞相類(lèi)似，但OB的陽(yáng)性細(xì)胞明顯較SVZa增多，且始終主要在神經(jīng)元樣細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，而RMS的陽(yáng)性細(xì)胞較少。熒光分光光度計(jì)檢測(cè)顯示熒光強(qiáng)度由高到低依次為OB、SVZa和RMS。以上結(jié)果表明BMP4在SVZa神經(jīng)干細(xì)胞遷移和分化的不同部位和不同時(shí)期存在差異表達(dá)，提示BMP4在SVZa神經(jīng)干細(xì)胞發(fā)育的不同時(shí)期、不同部位發(fā)揮不同的生

5、理作用。 3.BMP4對(duì)SVZa神經(jīng)干細(xì)胞增殖的影響細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示在1、2、5ng/ml濃度時(shí)，BMP4促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖，以2ng/ml濃度最明顯；10、20、50、100ng/ml濃度時(shí)，BMP4抑制神經(jīng)干細(xì)胞的增殖，濃度越高，抑制作用越明顯。流式細(xì)胞儀周期分析結(jié)果表明，在1-5ng/ml濃度時(shí)，靜止期細(xì)胞減少，DNA合成期細(xì)胞增加，仍以2ng/ml濃度明顯；10-100ng/ml濃度時(shí)，靜止期細(xì)胞大量增加，分裂期和S期

6、細(xì)胞銳減。以上結(jié)果提示不同濃度的BMP4通過(guò)對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控影響SVZa神經(jīng)干細(xì)胞的增殖，低濃度BMP4促進(jìn)增殖，而高濃度BMP4則抑制其增殖。 4.BMP4對(duì)SVZa神經(jīng)干細(xì)胞分化的影響加入不同濃度的BMP4，2天時(shí)行MAP-2和NSE免疫熒光染色，結(jié)果顯示NSE陽(yáng)性細(xì)胞均增多，流式細(xì)胞儀檢測(cè)SVZa神經(jīng)干細(xì)胞分化結(jié)果表明，1-100ng/ml濃度BMP4在2天時(shí)均可促進(jìn)SVZa向神經(jīng)元分化，1-10ng/ml時(shí)逐漸增加，10

7、-100ng時(shí)處于一平臺(tái)；在7天時(shí)行NSE免疫熒光染色，結(jié)果顯示NSE陽(yáng)性細(xì)胞均有所減少，流式細(xì)胞儀檢測(cè)也得到相似的結(jié)果。加入10ng/ml濃度的BMP4，在不同時(shí)相點(diǎn)顯示神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元的分化，結(jié)果表明，BMP4在分化早期使神經(jīng)元比例增高，2天時(shí)達(dá)到高峰，4天時(shí)與對(duì)照組持平，此后下降。以上結(jié)果提示BMP4對(duì)體外培養(yǎng)的SVZa神經(jīng)干細(xì)胞具有雙重作用，在干細(xì)胞分化的早期增加神經(jīng)元分化比例，晚期則抑制神經(jīng)元的分化。 5.Noggi

8、n對(duì)BMP4的拮抗作用轉(zhuǎn)染PEGFP-Noggin質(zhì)粒后加入不同濃度的BMP4，行NSE免疫熒光染色，結(jié)果顯示Noggin能拮抗BMP4的作用，在早期使神經(jīng)元數(shù)目減少，在晚期使神經(jīng)元數(shù)目增多。流式細(xì)胞儀檢測(cè)證實(shí)了免疫熒光染色結(jié)果。以上結(jié)果提示Noggin可佶抗BMP4的作用，在分化早期抑制神經(jīng)元的分化，晚期促進(jìn)神經(jīng)元的分化。 6.BMP4影響SVZa神經(jīng)干細(xì)胞分化的活體熒光標(biāo)記SVZa神經(jīng)干細(xì)胞轉(zhuǎn)染Nestin-GFP質(zhì)粒，貼壁

9、分化8小時(shí)后即出現(xiàn)較多陽(yáng)性細(xì)胞，24小時(shí)后達(dá)到高峰，此后減弱。加入10ng/mlBMP4后，陽(yáng)性細(xì)胞大幅減少，在24-48小時(shí)內(nèi)與對(duì)照組比較尤為明顯，此后差異逐漸減小。熒光分光光度計(jì)定量檢測(cè)結(jié)果顯示，加入BMP4后1-3天內(nèi)Nestin增強(qiáng)子活性明顯減弱，而在4-7天內(nèi)與對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。轉(zhuǎn)染TH-GFP質(zhì)粒8小時(shí)后見(jiàn)到個(gè)別陽(yáng)性細(xì)胞，此后逐漸增多，48-72小時(shí)達(dá)到高峰。加入10ng/mlBMP4后，TH陽(yáng)性細(xì)胞有所增加，在24-48

10、小時(shí)內(nèi)與對(duì)照組比較有明顯差異。熒光分光光度計(jì)定量檢測(cè)結(jié)果顯示，加入BMP4后在1、2和3天時(shí)與對(duì)照組存在差異，而在4天后無(wú)明顯差異。 SVZa神經(jīng)干細(xì)胞轉(zhuǎn)染GFAP-GFP質(zhì)粒，貼壁分化8小時(shí)后見(jiàn)到陽(yáng)性細(xì)胞，此后逐漸增多。加入10ng/mlBMP4后，陽(yáng)性細(xì)胞均有所增加。與Nestin-GFP和TH-GFP標(biāo)記不同的是，GFAP啟動(dòng)子活性在觀察期內(nèi)持續(xù)增多。熒光分光光度計(jì)定量檢測(cè)結(jié)果顯示，加入BMP4后GFAP啟動(dòng)子活性在觀察期

11、內(nèi)(1-7天)持續(xù)增多，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。以上結(jié)果表明在分化的早期，BMP4使神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物(Nestin)的表達(dá)減少，多巴胺神經(jīng)元(TH)的標(biāo)志物增多，即神經(jīng)前體細(xì)胞減少，而成熟神經(jīng)元增多，而在晚期卻沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這顯示BMP4只是加速了神經(jīng)干細(xì)胞和組細(xì)胞的分化，并沒(méi)有特異性地誘導(dǎo)SVZa神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化。 7.BMP4對(duì)Mash1啟動(dòng)子活性的影響SVZa神經(jīng)干細(xì)胞轉(zhuǎn)染Mash1-LacZ質(zhì)粒，貼壁分化后1天行X-ga

12、l染色即出現(xiàn)一些陽(yáng)性細(xì)胞，主要在細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)，結(jié)合相差顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)大多為神經(jīng)元樣細(xì)胞著色。加入10ng/ml的BMP4，在分化后1-2天內(nèi)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)有所增加，此后陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增加不明顯，4天后則有所減少。細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果表明，加入BMP4后在分化的早期增強(qiáng)Mash1啟動(dòng)子活性，1天和2天時(shí)與對(duì)照組存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，在晚期有減弱Mash1啟動(dòng)子活性的趨勢(shì)，但與對(duì)照組比較差異不顯著。以上結(jié)果提示BMP4在SVZa神經(jīng)干細(xì)胞分化的早期誘導(dǎo)了Mash

13、1轉(zhuǎn)錄因子的產(chǎn)生。 通過(guò)對(duì)以上結(jié)果的綜合分析，結(jié)合參考文獻(xiàn)，本研究尚得出以下結(jié)論：1.本研究中采用的啟動(dòng)子活體熒光標(biāo)記實(shí)現(xiàn)了BMP4表達(dá)的活體追蹤，能夠反映正常情況下內(nèi)在蛋白的表達(dá)情況，而且動(dòng)態(tài)地顯示了神經(jīng)干細(xì)胞向多巴胺能神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞的分化過(guò)程，顯示其為一種較好的活體追蹤方法。 2.BMP4啟動(dòng)子活性分析顯示，在分化的晚期紅色熒光蛋白主要在膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)在7天時(shí)發(fā)現(xiàn)BMP4抑制神經(jīng)元的分化，而啟動(dòng)

14、子活性分析顯示BMP4持續(xù)性增加GFAP啟動(dòng)子活性，因此BMP4本身對(duì)SVZa神經(jīng)干細(xì)胞的特異性作用可能仍然為抑制神經(jīng)元的分化，促使其向星形膠質(zhì)細(xì)胞分化。 3.在嗅球周邊區(qū)域，原位雜交和啟動(dòng)子活性分析顯示BMP4為高表達(dá)，體外培養(yǎng)顯示高濃度的BMP4抑制干細(xì)胞的增殖，促使其退出細(xì)胞周期而分化，由于在嗅球主要為已定向的神經(jīng)元祖細(xì)胞，因此BMP4在嗅球周邊區(qū)域的主要作用可能是促使祖細(xì)胞退出細(xì)胞周期啟動(dòng)祖細(xì)胞的分化。 4.在R

15、MS和嗅球中央?yún)^(qū)，原位雜交和啟動(dòng)子活性分析顯示BMP4的表達(dá)量低，而低濃度的BMP4促進(jìn)祖細(xì)胞的增殖，不斷進(jìn)入細(xì)胞周期，因此在此部位，BMP4的作用可能為促進(jìn)其增殖，維持神經(jīng)元祖細(xì)胞狀態(tài)而不使其繼續(xù)分化。5.在SVZa，原位雜交和啟動(dòng)子活性分析顯示為中等量的表達(dá)，因此BMP4在SVZa可能具有更為復(fù)雜的作用，它既可促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向星形膠質(zhì)細(xì)胞分化，還可能具有促進(jìn)干細(xì)胞退出細(xì)胞周期的作用。在SVZp，原位雜交顯示為高豐度的BMP4mRNA