BMP-2在大鼠喙側(cè)遷移流的發(fā)育學(xué)表達(dá)及其對SVZa神經(jīng)干細(xì)胞體外分化調(diào)控的初步研究.pdf

1、隨著神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells, NSCs)研究的日漸深入,室管膜前下區(qū)(anterior subventricular zone, SVZa)作為目前公認(rèn)的哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)干細(xì)胞比較集中的一個(gè)重要區(qū)域,越來越受到人們的關(guān)注.SVZa來源的NSCs不僅具備所有神經(jīng)干細(xì)胞的共性,而且此處神經(jīng)干細(xì)胞產(chǎn)生后,將沿著一條特定的遷移通道――喙側(cè)遷移流(rostral migratory stream, RMS)朝嗅腦(

2、球)遷移,在遷移過程中始終保持增殖狀態(tài)和神經(jīng)元前體細(xì)胞的特征而不進(jìn)一步分化,到達(dá)其遷移終點(diǎn)后才進(jìn)一步分化為成熟的神經(jīng)元,成為嗅腦球中間神經(jīng)終生更新的來源,這也是SVZa神經(jīng)干細(xì)胞有別于其他來源神經(jīng)干細(xì)胞的主要特征.然而,在SVZa神經(jīng)干細(xì)胞增殖、遷移、分化的一系列過程中,不但制約于自身的遺傳基因,而且受到細(xì)胞所處微環(huán)境的影響,而微環(huán)境中多種細(xì)胞因子參與了調(diào)控.最新的研究顯示BMPs、Mash1、Pax6和Wnt等多種細(xì)胞因子和分子涉及了

3、這些復(fù)雜過程,但SVZa神經(jīng)干細(xì)胞增殖、遷移和分化的具體調(diào)控機(jī)制目前仍不清楚.骨形成蛋白(Bone Morphogenitic Proteins,BMPs)是轉(zhuǎn)化生長因子-β(Transforming Growth Factor-β,TGF-β)超家族成員,是一組具有多種功能的細(xì)胞因子,最初發(fā)現(xiàn)他們能夠在體外誘導(dǎo)骨和軟骨的形成而得名.目前在哺乳動(dòng)物體內(nèi)克隆和表達(dá)了二十多種BMPs成員,包括BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5等

4、等,他們結(jié)構(gòu)相似,功能相關(guān),廣泛分布于機(jī)體各處.BMPs通過與細(xì)胞膜上的特異性受體(BMPRs)結(jié)合,將信號傳導(dǎo)到胞內(nèi),促進(jìn)胞漿內(nèi)Smads家族成員的磷酸化,而后者形成功能復(fù)合物進(jìn)入核內(nèi),進(jìn)而調(diào)控下游目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄.BMP-2是BMPs成員中被研究得較為廣泛的一個(gè)因子,研究表明BMP-2不但對骨和軟骨的發(fā)生有促進(jìn)作用,而且參與神經(jīng)前體細(xì)胞的分化成熟與凋亡的調(diào)節(jié),對神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)生發(fā)育起著重要調(diào)控作用.研究發(fā)現(xiàn),BMP-2及其受體表達(dá)在神經(jīng)

5、系統(tǒng)發(fā)育的各個(gè)階段,對神經(jīng)干細(xì)胞的增殖與定向分化有一定影響,同時(shí)也有研究表明BMP-2濃度依賴性地誘導(dǎo)神經(jīng)前體細(xì)胞分化為神經(jīng)元.而相關(guān)研究證實(shí),BMP-2功能的實(shí)現(xiàn)依賴于其受體信號途徑,其中一條途徑是BMP-2-BMPRs-Smads-靶基因,BMP-2通過該信號途徑直接影響神經(jīng)干細(xì)胞的分化.然而,對于SVZa神經(jīng)干細(xì)胞,其由經(jīng)RMS遷移至嗅球并進(jìn)行最終分化,這個(gè)特殊而又復(fù)雜的遷移、分化過程中,BMP-2可能起到怎樣的調(diào)節(jié)作用,其具體機(jī)

6、制又是如何,目前還未見相關(guān)報(bào)道.雖然最近研究顯示一定濃度的人重組BMP-2(rhBMP-2)單獨(dú)作用于體外培養(yǎng)的SVZa神經(jīng)干細(xì)胞,能有效誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元.但其具體的作用機(jī)制還不清楚.在該實(shí)驗(yàn)中,我們首先用抗nestin、NF、GFAP和BMP-2等進(jìn)行免疫熒光染色,觀察在發(fā)育不同階段的大鼠腦內(nèi)SVZa神經(jīng)干細(xì)胞喙側(cè)遷移流通路上BMP-2的分布情況,同時(shí)結(jié)合RT-PCR技術(shù),對BMP-2在大鼠腦神經(jīng)干細(xì)胞喙側(cè)遷移流中的發(fā)育學(xué)表

7、達(dá)模式進(jìn)行深入的分析,得到如下結(jié)果:1.在大鼠發(fā)育的各個(gè)階段,NSCs自SVZa向嗅球遷移,形成明顯的神經(jīng)干細(xì)胞遷移流;nestin陽性細(xì)胞在SVZa區(qū)及其周圍,RMS遷移流主干和OB中央有較強(qiáng)表達(dá),但隨著大鼠的發(fā)育成熟,各部位nestin陽性細(xì)胞漸減;2.NF和GFAP在遷移流上表達(dá)較弱,主要表達(dá)在側(cè)腦室,SVZa區(qū)周圍,在RMS幾乎沒有GFAP的表達(dá),NF的表達(dá)也很低,但在OB周圍NF和GFAP均有較強(qiáng)表達(dá);3.BMP-2在喙側(cè)遷移

8、流的表達(dá)模式:①時(shí)間差異:在大鼠SVZa區(qū)、RMS主干部分和嗅球三個(gè)部位,BMP-2的表達(dá)水平在胚胎14d明顯高于出生后1d、7d和成年三個(gè)時(shí)間點(diǎn),差異較為顯著,在出生后0d和7d這兩個(gè)時(shí)相點(diǎn)上,BMP-2的表達(dá)水平相似,而成年BMP-2水平為最低.②空間差異:胚胎14天,BMP-2在SVZa表達(dá)水平最高,嗅球次之,而其他三個(gè)時(shí)相點(diǎn)嗅球表達(dá)較高,在SVZa區(qū)的表達(dá)居次,在RMS表達(dá)量始終最低.以上結(jié)果證實(shí)了喙側(cè)遷移流主要由SVZa來源的

9、神經(jīng)干細(xì)胞組成,而BMP-2在遷移流通路上的表達(dá)模式提示其不但參與了SVZa神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和遷移,而且對其分化可能也有重要的影響,為了進(jìn)一步證實(shí)BMP-2對SVZa神經(jīng)干細(xì)胞分化的作用,我們體外培養(yǎng)了SVZa神經(jīng)干細(xì)胞,用不同濃度的BMP-2蛋白對體外培養(yǎng)的SVZa神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo),初步探討了BMP-2對SVZa神經(jīng)干細(xì)胞的分化的影響,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:1.在無血清等其他因子條件下,BMP-2可以有效刺激SVZa神經(jīng)干細(xì)胞分化,與自然條

10、件相比,有加速神經(jīng)干細(xì)胞分化趨勢.BMP-2抑制SVZa神經(jīng)干細(xì)胞表達(dá)nestin,促進(jìn)其分化成熟;2.在5-25ng/ml濃度范圍內(nèi),BMP-2均不同程度的促進(jìn)SVZa神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元方向分化,并且有輕微抑制SVZa神經(jīng)干細(xì)胞向膠質(zhì)細(xì)胞方向分化的作用,其中10ng/ml是促進(jìn)SVZa神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化的最佳濃度;3.在5-25ng/ml濃度的BMP-2有利于SVZa神經(jīng)干細(xì)胞分化為TH陽性神經(jīng)元,其中10ng/ml濃度效果最佳,

11、但TH陽性神經(jīng)元的比例整體較低.上述結(jié)果證實(shí)了BMP-2濃度依賴性地對體外培養(yǎng)的SVZa神經(jīng)干細(xì)胞的定向分化具有一定的影響,為了明確BMP-2對SVZa神經(jīng)干細(xì)胞分化調(diào)控的可能分子機(jī)制,我們擬用實(shí)驗(yàn)中的最佳作用濃度――10ng/ml BMP-2刺激下,在不同的時(shí)相點(diǎn),觀察在分化的不同時(shí)期BMP-2信號途徑中胞漿內(nèi)Smads成員Smad1和Smad5的磷酸化水平,同時(shí)檢測胞漿內(nèi)形成Smad1/5/4復(fù)合物的含量,結(jié)果如下:1.10ng/m

12、l BMP-2作用于SVZa神經(jīng)干細(xì)胞,30min內(nèi)明顯促進(jìn)了干細(xì)胞胞漿內(nèi)Smad1/5的磷酸化,刺激后2h胞漿內(nèi)Smad1/5的磷酸化水平明顯下降;2.10ng/ml BMP-2作用于SVZa神經(jīng)干細(xì)胞,30min內(nèi)明顯促進(jìn)了干細(xì)胞胞漿內(nèi)Smad1/5/4復(fù)合物形成,2h至12h,Smad1/5/4復(fù)合物逐漸減少.這些結(jié)果提示BMP-2對SVZa神經(jīng)干細(xì)胞的分化調(diào)控可能是通過BMP-2-BMPR-Samds信號途徑實(shí)現(xiàn),這種調(diào)控發(fā)生在