自噬調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞的分化潛能.pdf

1、目的：
　　觀察源自不同年齡階段小鼠神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)分化能力的改變，與自噬基因的表達(dá)變化，探討自噬對NSCs分化能力的調(diào)控作用。
　　方法：
　　分離提取胚胎14d(E14)、新生(P0)、生后30d(P30)和90d(P90)小鼠NSCs，應(yīng)用NSCs標(biāo)記物 nestin進(jìn)行免疫熒光染色鑒定實(shí)驗(yàn)。NSCs經(jīng)1％胎牛血清誘導(dǎo)分化后， Tuj1和GFAP免疫熒光染色比較不同年齡NSCs分化為神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的比例。

2、分離培養(yǎng)P0和P300小鼠NSCs制備超薄切片，應(yīng)用透射電鏡觀察NSCs超微結(jié)構(gòu)。采用SYBR Green Real-time PCR(QPCR)分析不同年齡小鼠側(cè)腦室室管膜下區(qū)(SVZ)和不同年齡階段NSCs，自噬相關(guān)基因ATG3，ATG5，ATG7及Beclin1的表達(dá)變化。另外，觀察 NSCs分化前后自噬相關(guān)基因的表達(dá)變化。并且分別應(yīng)用1μM、5μM和10μM自噬抑制劑Ly294002作用于NSCs，通過Tuj1和GFAP免疫熒光

3、染色分析自噬對神經(jīng)干細(xì)胞分化能力的影響。
　　結(jié)果：
　　1.隨著年齡增長NSCs形成神經(jīng)球的平均直徑降低，P30和P90 NSCs形成70～100μm神經(jīng)球的數(shù)量較E14和P0降低～65%。誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示隨年齡增加， NSCs分化為神經(jīng)元的比例降低(P<0.05)，而分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞的能力上升(P<0.05)。其中P90小鼠Tuj1的陽性率為8%±2%，較E14小鼠(29%±3%)明顯下降(P<0.01)而其GFA

4、P陽性細(xì)胞率為72%±4%，較E14小鼠(39%±3%)明顯升高(P<0.01)。
　　2.透射電鏡結(jié)果顯示P300 NSCs線粒體嵴出現(xiàn)斷裂腫脹，正常狀態(tài)的線粒體數(shù)目較P0明顯減少，并且內(nèi)聚集大量自噬小體，提示P300 NSCs自噬功能降低。QPCR結(jié)果顯示隨年齡增長 SVZ自噬相關(guān)基因 ATG3、ATG5、ATG7的表達(dá)水平降低,但Beclin1表達(dá)水平無顯著變化。P90 NSCs ATG3、ATG5、ATG7和Beclin1

5、表達(dá)水平分別較E14下降約60%、52%、66%和84%。提示隨著年齡增長NSCs自噬活性逐步下調(diào)。
　　3. NSCs誘導(dǎo)分化培養(yǎng)5d后，Tuj1和GFAP的表達(dá)量分別較對照組增高4.30±0.65倍(P<0.05)和11.39±0.35倍(P<0.05)。同時(shí)，ATG3、ATG5、ATG7和Beclin1mRNA表達(dá)水平分別較未分化前增高1.47±0.34(P<0.05)、1.66±0.79(P<0.05)、4.31±0.94

6、(P<0.05)和3.73±2.56(P<0.05)；提示自噬可能參與了NSCs向神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞的分化。分別用1μM、5μM和10μM自噬抑制劑Ly294002干預(yù)E14 NSCs分化后，發(fā)現(xiàn)ly294002能夠抑制NSCs向神經(jīng)元分化，并且表現(xiàn)出濃度依賴性，而對星形膠質(zhì)細(xì)胞無明顯影響。Ly294002處理組 Tuj1的陽性率分別為 DMSO組的109%±2%(P>0.05)、41%±2%(P<0.05)和30%±1%(P<0.0

7、5)；而 Ly294002處理組GFAP的陽性率分別為 DMSO組的112%±1%(P>0.05)、89%±2%(P>0.05)和113%±3%(P>0.05)，提示自噬主要調(diào)控NSCs向神經(jīng)元的分化。
　　結(jié)論：
　　1.隨年齡增長NSCs分化為神經(jīng)元的數(shù)量逐漸減少，而分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞的比例上升。
　　2.成年NSCs內(nèi)自噬小體堆積并且自噬相關(guān)基因的表達(dá)水平顯著降低，提示自噬與NSCs功能維持相關(guān)。
　　3.