人胚胎干細(xì)胞分化為可自我更新的神經(jīng)干細(xì)胞.pdf

1、人胚胎干細(xì)胞（Human Embryonic Stem Cells，hESCs）是一種可以在體外穩(wěn)定自我更新，并具有分化為成人機(jī)體任何一種細(xì)胞潛能的多能干細(xì)胞(Pluripotent StemCells，PSCs)。通過(guò)hESCs定向分化可以得到通常情況下難以獲得，但對(duì)疾病治療具有重要價(jià)值的細(xì)胞。因此，多能干細(xì)胞在再生醫(yī)學(xué)中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)而言，許多神經(jīng)退行性疾病通常涉及神經(jīng)元的死亡和缺失，如中腦多巴胺神經(jīng)元死亡與帕金森病

2、（Parkinson's Disease，PD）密切相關(guān)，而阿爾茨海默癥(Alzheimer's Disease，AD)患者存在前腦基底膽堿能神經(jīng)元(Basal ForebrainCholinergic Neurons，BFCNs)的缺失。細(xì)胞移植有望改善神經(jīng)退行性疾病的病理狀態(tài)，對(duì)其產(chǎn)生重要的治療作用，而通過(guò)人多能干細(xì)胞(Human Pluripotent Stem Cells，hPSCs)的定向分化獲得特定類(lèi)型的神經(jīng)元將為神經(jīng)退行性

3、疾病的細(xì)胞治療提供重要支持。目前利用化學(xué)生物學(xué)手段，即用活性小分子化合物調(diào)控干細(xì)胞命運(yùn)已經(jīng)成為干細(xì)胞研究中的熱點(diǎn)領(lǐng)域。小分子化合物通過(guò)靶向特定分子在調(diào)控細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，細(xì)胞能量代謝和表觀遺傳學(xué)機(jī)制等方面具有顯著的優(yōu)勢(shì):如其功能具有可逆性、其作用強(qiáng)度可以通過(guò)自身濃度進(jìn)行調(diào)節(jié)等。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)用小分子化合物同時(shí)抑制GSK3（Glycogen Synthase Kinase3）以及TGFβ(Transforming Growth Facto

4、rβ)和Notch信號(hào)通路，可高度特異的將人胚胎干細(xì)胞在一周時(shí)間內(nèi)誘導(dǎo)分化為原始神經(jīng)干細(xì)胞。但是，通過(guò)該方法獲得的神經(jīng)上皮通常具有后端化的表型，這可能與抑制GSK3導(dǎo)致Wnt信號(hào)通路的激活有關(guān)。本課題擬在前期研究的基礎(chǔ)上，利用化學(xué)生物學(xué)手段誘導(dǎo)hESCs分化獲得具有前腦表型的神經(jīng)干細(xì)胞。
　　本課題以人胚胎干細(xì)胞系H1和HUES9為研究對(duì)象，用無(wú)血清無(wú)飼養(yǎng)層的培養(yǎng)體系培養(yǎng)和傳代。在光鏡下hESCs邊緣清晰，排列緊密，細(xì)胞核大而細(xì)胞

5、質(zhì)少;細(xì)胞免疫熒光染色OCT4（Octamer-binding Transcription Factor4）陽(yáng)性，表明hESCs處于未分化狀態(tài)。通過(guò)聯(lián)合使用TGFβ抑制劑SB431542和Notch抑制劑RO4929097高效率的將人胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為PAX6(Paired Box Protein6)和Nestin陽(yáng)性的神經(jīng)上皮。進(jìn)一步，利用低濃度GSK3抑制劑CHIR99021和SB431542，可維持神經(jīng)上皮的長(zhǎng)期自我更新，該細(xì)胞

6、表達(dá)前腦標(biāo)志FOXG1(Forkhead Box Protein G1)、OTX2(Orthodenticle Homeobox2)，神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志PAX6、早期神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志Nestin，和細(xì)胞增殖標(biāo)志分子Ki67，表明該細(xì)胞是具有前腦表型的前腦神經(jīng)干細(xì)胞（Forebrain Neural Stem Cells，fNSCs）。該細(xì)胞可以響應(yīng)SHH(Sonic Hedgehog)誘導(dǎo)的腹側(cè)化作用，得到MAP2(Microtubule-As

7、sociated Protein2)、NKX2.1(NK2Homeobox1)和GABA（Gamma-Aminobutyric Acid）陽(yáng)性的腹側(cè)前腦中間神經(jīng)元。然而，值得注意的是，上述神經(jīng)干細(xì)胞PAX6陽(yáng)性，提示其在背腹軸上可能偏向背側(cè)定位。隨后研究中，我們嘗試在神經(jīng)誘導(dǎo)過(guò)程中加入腹側(cè)誘導(dǎo)因子SHH是否可以獲得具有腹側(cè)表型的神經(jīng)干細(xì)胞。通過(guò)使用腹側(cè)誘導(dǎo)因子SHH及其激活劑SAG(Smoothened Agonist)、TGFβ抑制劑

8、SB431542等誘導(dǎo)hESCs神經(jīng)分化，得到腹側(cè)標(biāo)志NKX2.1和前腦標(biāo)志FOXG1陽(yáng)性的腹側(cè)前腦神經(jīng)干細(xì)胞(Ventral ForebrainNeural Stem Cells，vfNSCs)。該細(xì)胞可在GSK3抑制劑CHIR99021，TGFβ受體抑制劑SB431542和SHH存在的條件下自我更新，并表達(dá)前腦神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志FOXG1、OTX2，早期神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志Nestin和細(xì)胞增殖標(biāo)志分子Ki67;此外，該細(xì)胞還表達(dá)腹側(cè)標(biāo)志NKX2

9、.1，表明其具有腹側(cè)前腦神經(jīng)干細(xì)胞的表型。進(jìn)一步通過(guò)聯(lián)合使用Wnt抑制劑XAV-939、Notch抑制劑RO4929097和SHH，可將上述腹側(cè)前腦神經(jīng)干細(xì)胞快速誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元。分化后的神經(jīng)元表達(dá)腹側(cè)標(biāo)志NKX2.1、ISL1(InsulinGene Enhancer Protein1)，神經(jīng)元特異骨架蛋白MAP2，大多數(shù)神經(jīng)元為GABA能神經(jīng)元，表達(dá)GAD65（Glutamic Acid Decarboxylase65），且GABA

10、呈陽(yáng)性;只有少部分細(xì)胞表達(dá)膽堿能神經(jīng)元標(biāo)志ChAT（Choline Acetyltransferase）。
　　綜上所述，本課題通過(guò)化學(xué)生物學(xué)手段成功的將人胚胎干細(xì)胞定向分化為前腦神經(jīng)干細(xì)胞，并可進(jìn)一步高效的將神經(jīng)干細(xì)胞分化為前腦抑制性中間神經(jīng)元。本課題建立的定向分化體系不僅可以作為體外研究前腦發(fā)育的細(xì)胞平臺(tái)，同時(shí)有效的前腦抑制性中間神經(jīng)元獲取手段也有望為阿爾茨海默癥、Huntington舞蹈癥等神經(jīng)退行性疾病的干細(xì)胞治療提供穩(wěn)定