補腎中藥誘導人胚胎干細胞分化為類卵泡結構的研究.pdf

1、目的：
　　應用含補腎中藥血清研究補腎方對人胚胎干細胞體外分化為類卵泡結構的研究。
　　方法：
　　以H9人胚胎干細胞為實驗對象，誘導H9細胞形成擬胚體(EB)，加入含22、23、24、25、26、27＃方的含藥血清，血清濃度為3％；另以分化誘導因子骨形成蛋白4(BMP4)作為陽性對照，BMP4終濃度為100pg/ml；以不加BMP4的完全培養(yǎng)液作為空白對照。顯微鏡動態(tài)觀察H9擬胚體生長和分化的形態(tài)學變化；采用實時熒光

2、定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR)技術檢測EB和分化細胞生殖分化標志基因的表達；采用免疫熒光技術檢測生殖細胞分化相關的標志蛋白表達；應用酶聯免疫(ELIS)A技術定量測定了分化后期培養(yǎng)液中E2含量。
　　實驗產生的數據均使用SPSS19.0統(tǒng)計學軟件處理，若同時滿足正態(tài)分布和方差齊性，則取用 x±s表示，運用單因素方法分析和配對T檢驗進行檢測。
　　結果：
　　1.含補腎中藥血清誘導H9擬胚體生長及分化
　　1.

3、1各含藥血清組可明顯促進EB的生長和誘導EB分化，在誘導分化第3天出現與陽性對照類似的早期分化特征：大量細胞從EB游離，EB逐漸縮小呈不規(guī)則形；同時收集EB及游離細胞檢測胚胎干細胞分化標志基因Oct-4 mRNA的表達。結果顯示：加入含藥血清前其Oct-4基因大量表達，加入含藥血清培養(yǎng)第3天，各組EBOct-4 mRNA明顯下調，表明含補腎中藥血清在短期內即啟動EB分化。
　　1.2進一步檢測了與生殖發(fā)育相關的基因表達，各含藥血清

4、組對生殖分化相關基因的表達有明顯差異,其中23＃含藥血清在誘導GDF9、ZP1和SCP3的表達均強于BMP4。進一步采用免疫熒光技術檢測了23＃含藥血清組誘導EB分化第5天GDF9的蛋白表達。與mRNA水平檢測結果一致，陰性對照組因具有自發(fā)分化特性，GDF9有較弱表達；BMP4和23＃含藥血清誘導的GDF9表達明顯增強，且23＃含藥血清優(yōu)于BMP4。
　　2.含補腎中藥血清誘導人胚胎干細胞向生殖特異性組織細胞分化
　　2.1

5、含藥血清誘導分化5-7天，BMP-4陽性對照組和23、25、26＃含藥血清組均可觀察到一類明顯大于其它分化類型的細胞，該類該細胞直徑大于50μm，形態(tài)酷似類卵細胞。繼續(xù)延長培養(yǎng)分化時間至7-10天，類卵細胞直徑增加，其邊緣逐漸形成細小顆粒；誘導分化至11-16天，類卵細胞邊緣的顆粒層隨時間延長而增厚，胞體直徑均大于100μm，某些顆粒層呈現扁平狀結構。推定這類被顆粒細胞層包裹的細胞為類卵泡結構（follicle-like structu

6、res, FLSs）。
　　為了證實含藥血清誘導分化的類卵泡結構，選擇23＃含藥血清誘導分化并持續(xù)16天，在顯微鏡下觀察和記錄了FLSs形成的動態(tài)變化。綜合分析結果顯示，含藥血清以及BMP4可在5-16天內，誘導H9胚胎干細胞形成至少3種FLSs結構，包括從始基卵泡（primordial follicles）→初級卵泡（primary follicles）→次級卵泡（secondary follicles）的發(fā)育。
　　2.

7、2補腎中藥誘導分化類卵泡形成的分子標志物鑒定
　　2.2.1原始卵泡期的分子標志物分析
　　為了進一步證實類卵泡結構的形成，選擇23＃含藥血清，培養(yǎng)H9細胞3-7天，在原始卵泡形成數量較多時，應用RT-qPCR技術檢測原始卵泡形成過程中3種分子標志物表達的動態(tài)變化。23＃含藥血清在誘導分化3、5、7天，均上調GDF9和SCP3的表達，呈現時間依賴性；23＃含藥血清也誘導VASA表達，但在分化第7天表達下調。GDF9和SCP3

8、表達的時間依賴性與原始卵泡在體外分化發(fā)育的時間基本一致；VASA基因在誘導分化第7天表達下調，提示VASA的表達與始基卵泡發(fā)育有關。另選擇23＃含藥血清誘導培養(yǎng)第7天的原始卵泡，檢測了GDF9的蛋白表達，與基因表達水平一致，在單個類卵泡結構中顯示較強的熒光信號。
　　2.2.2生長卵泡期的分子標志物分析
　　另收集培養(yǎng)7-16天的分化細胞，檢測了生長卵泡形成期間3種分子標志物表達的動態(tài)變化。23＃含藥血清誘導分化7、9、11

9、天，均上調ZP1、ZP2和ZP3表達，并呈現時間依賴性。對23＃含藥血清誘導培養(yǎng)第11天的生長卵泡，檢測了ZP1的蛋白表達，結果顯示在單個生長卵泡結構的顆粒層與卵母細胞之間有較強的熒光信號。
　　2.3補腎中藥誘導的卵母細胞發(fā)育的形態(tài)學特征
　　原始卵泡和生長卵泡期的卵母細胞為初級卵母細胞，具有減數分裂I各期特征，為了證實含藥血清誘導的初級卵母細胞形成的減數分裂I特征，采用免疫熒光技術，應用β-actin染色細胞骨架，Hoe

10、chst33258染色減數分裂各期的核結構，以此鑒定被顆粒層包裹的類卵母細胞。結果顯示，23＃血清誘導分化7-16天的類卵細胞包括有卵原細胞和處于細線期、偶線期、粗線期的初級卵母細胞；在含藥血清誘導分化過程中偶見處于雙線期的卵母細胞。這從減數分裂前各期的形態(tài)學特征進一步證實了補腎中藥可誘導類卵泡結構形成。
　　2.4補腎中藥誘導分化形成的前顆粒細胞分子標志物及功能評價
　　2.4.1前顆粒細胞分子標志物分析
　　收集誘

11、導第11天的分化細胞，檢測了顆粒細胞標志物FSHr mRNA的表達，其中23＃含藥血清組FSHr mRNA表達明顯高于BMP4陽性對照。特針對23＃含藥血清誘導培養(yǎng)第11天的生長卵泡，檢測了Aromatase的蛋白表達，結果顯示在單個生長卵泡結構外緣的顆粒層有較強的熒光信號。
　　2.4.2前顆粒細胞功能評價
　　向各組培養(yǎng)液中添加終濃度為50ng/ml的睪酮，收集誘導分化第9和11天的培養(yǎng)液，檢測培養(yǎng)液中E2的表達情況：在

12、誘導分化第9天，23＃含藥血清組其培養(yǎng)上清中的E2濃度顯著高于陰性對照組，略低于BMP4組；在誘導分化第11天，23＃含藥血清組其培養(yǎng)上清中的E2濃度明顯增加，顯著高于BMP4組。在誘導分化第11天，向各組培養(yǎng)液中加入終濃度為0.1IU/mL的FSH，培養(yǎng)48h后，各組培養(yǎng)液中E2濃度均較添加FSH之前明顯升高，23＃含藥血清組中E2濃度顯著高于BMP4組，提示BMP4和23＃含藥血清誘導分化的類卵泡結果具有一定的功能。
　　結論

13、：
　　1.本研究培養(yǎng)的EB處于未分化狀態(tài),且具有多能性；含補腎中藥的血清可明顯促進EB生長，并在短期內啟動分化程序，表明補腎中藥具有快速誘導人胚胎干細胞體外分化的能力。
　　2.含補腎中藥血清可促進人胚胎干細胞體外分化為類卵泡結構，包括由始基卵泡→初級卵泡→次級卵泡的發(fā)育，但在本實驗條件下，未觀察到成熟卵泡的形成。表明含藥血清可誘導人胚胎干細胞形成類卵泡結構，但FLSs的發(fā)育停留在竇前卵泡階段。
　　3.誘導分化的類

14、卵泡結構中的卵母細胞具有減數分裂I的形態(tài)特征，包括卵原細胞和處于細線期、偶線期、粗線期的初級卵母細胞。
　　4.誘導分化的類卵泡結構中逐漸生成的前顆粒細胞具有合成雌激素的功能，對FSH有明顯反應。
　　綜上，通過含補腎中藥血清體外誘導人胚干細胞分化的研究為表明，補腎中藥具有誘導人胚干細胞分化為類卵泡結構，具有合成雌激素的功能。本研究應用人胚胎干細胞成功誘導分化為類卵泡結構為首次報道，為人胚干細胞的生殖細胞定向分化以及補腎中藥