含補(bǔ)腎中藥鼠血清對人胚胎干細(xì)胞體外分化為類卵巢顆粒細(xì)胞影響的研究.pdf

1、目的：觀察含補(bǔ)腎中藥鼠血清對人胚胎干細(xì)胞體外分化為類卵巢顆粒細(xì)胞的影響及可能的相關(guān)機(jī)制
　　第一部分：人胚胎干細(xì)胞體外分化為類卵巢顆粒細(xì)胞潛能的研究
　　方法：
　　人胚胎干細(xì)胞H9生長在飼養(yǎng)層細(xì)胞上形成克隆團(tuán)，轉(zhuǎn)入超低吸附板形成擬胚體，擬胚體（加入BMP4，WNT3A，activin-A，bFGF）培養(yǎng)5天后細(xì)胞分組貼壁誘導(dǎo)分化7天，誘導(dǎo)因子組加入誘導(dǎo)因子，陰性對照組用干細(xì)胞完全培養(yǎng)液，將干細(xì)胞擬胚體定向誘導(dǎo)分化為類

2、卵巢顆粒細(xì)胞；在誘導(dǎo)分化的不同時(shí)間段，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，評價(jià)誘導(dǎo)分化的細(xì)胞形態(tài)學(xué)是否與人顆粒細(xì)胞相似，用免疫熒光染色及RT-PCR檢測卵巢顆粒細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)來鑒定誘導(dǎo)分化的細(xì)胞是否為顆粒細(xì)胞，酶聯(lián)免疫法檢測檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中FSH刺激前后E2的含量，評價(jià)分化后的細(xì)胞的內(nèi)分泌功能，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。
　　結(jié)果：誘導(dǎo)分化后的H9細(xì)胞形態(tài)學(xué)與人顆粒細(xì)胞兩者在形態(tài)學(xué)上相似；細(xì)胞免疫熒光染色結(jié)果:誘導(dǎo)因子組的細(xì)胞表達(dá)較強(qiáng)的人卵巢顆粒細(xì)

3、胞標(biāo)志物的熒光標(biāo)記；分化后細(xì)胞對顆粒細(xì)胞特異性標(biāo)志物的mRNA表達(dá)增強(qiáng)；誘導(dǎo)因子組細(xì)胞培養(yǎng)液中E2的濃度逐漸升高，在FSH作用下培養(yǎng)液中E2濃度明顯升高，與人顆粒細(xì)胞相似。而陰性組無論是細(xì)胞形態(tài)還是顆粒細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)和E2的分泌都沒有明顯的變化。
　　小結(jié)：人胚胎干細(xì)胞H9在體外加入誘導(dǎo)因子后具有分化為類卵巢顆粒細(xì)胞的潛力；因此，H9可作為評價(jià)補(bǔ)腎中藥鼠血清對人胚胎干細(xì)胞體外分化為類卵巢顆粒細(xì)胞的影響的研究平臺。
　　第二部

4、分：含補(bǔ)腎中藥鼠血清對人胚胎干細(xì)胞體外分化為類卵巢顆粒細(xì)胞影響的研究
　　方法：
　　1、各類含補(bǔ)腎中藥鼠血清的制備：在體重均一的情況下隨機(jī)將60只大鼠分成6組：22號藥組、23號藥組、24號藥組、25號藥組，26號藥組、27號藥組，每組10只，雌雄各半?？瞻捉M大鼠灌服蒸餾水，補(bǔ)腎中藥組大鼠分別灌服對應(yīng)號碼的中藥，給藥劑量均為5.0g/kg，給藥容量均為20ml/kg。分別于給藥后90min股動脈取血，血液靜置2小時(shí)后，30

5、00rpm離心15min，分離各組血清，HPLC分析血清，過濾除菌，-80℃保存?zhèn)溆谩?br>　　2、含組補(bǔ)腎中藥鼠血清誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞體外分化為類卵巢顆粒細(xì)胞影響的研究：人胚胎干細(xì)胞形成克隆團(tuán)、擬胚體（同上）后分組貼壁誘導(dǎo)分化，各組加入2％含補(bǔ)腎中藥鼠血清定向誘導(dǎo)分化7天；設(shè)Factor組為陽性對照組，Medium組為陰性對照組，在誘導(dǎo)分化的不同時(shí)間段（同第一部分）細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、免疫熒光染色及RT-PCR檢測顆粒細(xì)胞標(biāo)志物鑒定分化后

6、的細(xì)胞以及ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中FSH刺激前后E2的含量，評價(jià)分化后細(xì)胞的內(nèi)分泌功能。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析比較各組參數(shù)之間的差異，實(shí)驗(yàn)重復(fù)兩次。
　　結(jié)果：含補(bǔ)腎中藥鼠血清誘導(dǎo)分化后細(xì)胞形態(tài)學(xué)與人顆粒細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上相似，各組補(bǔ)腎中藥鼠血清誘導(dǎo)分化的細(xì)胞能不同程度的表達(dá)人卵巢顆粒細(xì)胞標(biāo)志物的免疫熒光標(biāo)記；分化后的各組細(xì)胞對顆粒細(xì)胞特異性標(biāo)志物mRNA表達(dá)增強(qiáng)，以25號、26號含補(bǔ)腎中藥鼠血清組的細(xì)胞表達(dá)尤為顯著；各組細(xì)胞（含23、25、2

7、6號、27號補(bǔ)腎中藥血清組）培養(yǎng)液中E2濃度均高于Factor組，在FSH作用下25、26號補(bǔ)腎中藥血清組誘導(dǎo)的細(xì)胞培養(yǎng)液中E2濃度升高尤為顯著(P<0.05)。
　　小結(jié)：補(bǔ)腎中藥具有在體外誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞向卵巢顆粒細(xì)胞分化的能力，誘導(dǎo)分化后的類卵巢顆粒細(xì)胞有分泌E2的功能。6個(gè)樣品中有4個(gè)樣品誘導(dǎo)的細(xì)胞具有分泌E2功能，F(xiàn)SH刺激下2個(gè)樣品誘導(dǎo)的細(xì)胞分泌E2功能尤為顯著。
　　第三部分：含補(bǔ)腎中藥鼠血清誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞體

8、外分化為類卵巢顆粒細(xì)胞的機(jī)理研究
　　方法：選擇上述實(shí)驗(yàn)中：細(xì)胞培養(yǎng)液中E2濃度升高且在FSH作用下E2水平升高尤為顯著的、對顆粒細(xì)胞特異性標(biāo)志物的mRNA表達(dá)顯著增強(qiáng)的25號、26號含補(bǔ)腎中藥鼠血清作為進(jìn)一步的研究對象；細(xì)胞培養(yǎng)及擬胚體形成方法同第一、第二部分，在擬胚體貼壁后分別加入25號、26號補(bǔ)腎中藥鼠血清，在分化的第0天、第3天、第5天，收集細(xì)胞，RT-PCR檢測兩組補(bǔ)腎中藥誘導(dǎo)的細(xì)胞分化后卵巢顆粒細(xì)胞特異性基因FSHRm

9、RNA、CYP19A1mRNA、AMHmRNA以及通路相關(guān)的BMP6mRNA、SMAD8mRNA、bFGFmRNA的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)兩次。
　　結(jié)果：與第0天比較含25號、26號補(bǔ)腎中藥鼠血清體外誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞擬胚體貼壁分化3天細(xì)胞BMP6mRNA、SMAD8mRNA的表達(dá)顯著升高，第5天下降；而兩組貼壁分化第0天到第5天卵巢顆粒細(xì)胞特異性標(biāo)志物FSHRmRNA、CYP19A1mRNA、AMHmRNA以及bFGFmRNA表達(dá)均持續(xù)

10、升高。
　　結(jié)論：綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們可以得出一個(gè)結(jié)論：補(bǔ)腎中藥復(fù)方能在體外促進(jìn)卵巢顆粒細(xì)胞的分化，BMP/Smads信號通路是補(bǔ)腎中藥促進(jìn)人胚胎干細(xì)胞H9體外誘導(dǎo)分化為類卵巢顆粒細(xì)胞的可能通路之一；含25、26號補(bǔ)腎中藥鼠血清通過BMP/Smads信號通路的傳導(dǎo)，促進(jìn)人胚胎干細(xì)胞H9體外誘導(dǎo)定向分化，分化的細(xì)胞具備類似人顆粒細(xì)胞的功能。這將為從細(xì)胞和分子水平來闡明補(bǔ)腎中藥在治療人類生殖功能障礙疾?。ㄈ缏殉苍缢?、卵巢儲備功能下降