小鼠胚胎干細(xì)胞直接誘導(dǎo)分化為功能性肝臟細(xì)胞的研究.pdf

1、目前，對(duì)于肝功能衰竭(如肝壞死、肝硬化等)和肝臟相關(guān)的遺傳性疾病的治療主要依賴于原位肝移植，但供體肝來源嚴(yán)重不足和移植排斥等問題限制了這一治療手段的廣泛開展。肝細(xì)胞移植和生物人工肝作為肝移植的輔助方式，可以部分緩解上述問題，但其來源細(xì)胞同樣也面臨著存活期短，特別是隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，肝功能逐漸降低等問題，因此，尋找合適的肝細(xì)胞來源已成為一個(gè)十分緊迫的課題。 胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell，ESCs)是來源于囊

2、胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的一種高度未分化細(xì)胞，具有無限增殖和發(fā)育全能性等特點(diǎn)，可白發(fā)分化為多種細(xì)胞類型，在特定的誘導(dǎo)條件下，也可以向某種組織細(xì)胞類型分化。目前，已知ESCs可定向分化為神經(jīng)細(xì)胞、心肌細(xì)胞、造血細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等多種細(xì)胞類型。在非肝源性肝干細(xì)胞研究領(lǐng)域，自從2001年Harnazaki等[1]首次報(bào)道誘導(dǎo)ESCs分化為肝臟細(xì)胞以來，ESCs源性肝臟細(xì)胞的體外研究在多個(gè)研究中心迅速開展起來，目前已明確可以由ESCs獲得表達(dá)肝臟特

3、異性標(biāo)志物的肝細(xì)胞樣細(xì)胞。但至今仍沒有建立一個(gè)統(tǒng)一高效的誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞向肝細(xì)胞分化的培養(yǎng)體系。 本課題擬運(yùn)用不經(jīng)過擬胚體(Embryoid body, EBs)途徑的直接誘導(dǎo)方法，探討表觀遺傳修飾物質(zhì)下酸鈉(sodium butyrate，SB)聯(lián)合多種細(xì)胞因子體外誘導(dǎo)小鼠胚胎干細(xì)胞分化為功能性肝臟細(xì)胞可行性，建立有效的誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞向肝細(xì)胞分化的培養(yǎng)體系。并在此研究基礎(chǔ)上，利用在誘導(dǎo)過程中消化傳代的方法，提高ESCs源性肝臟細(xì)

4、胞的獲得效率，解決由于長時(shí)間誘導(dǎo)帶來的如細(xì)胞老化、功能下降等一系列問題，從而為將來ESCs源性肝臟細(xì)胞移植治療各種難治性肝病提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 小鼠胚胎干細(xì)胞直接誘導(dǎo)分化為功能性肝臟細(xì)胞 目的： 運(yùn)用直接誘導(dǎo)的方法，探討表觀遺傳修飾聯(lián)合多種細(xì)胞因子體外誘導(dǎo)小鼠胚胎干細(xì)胞分化為功能性肝臟細(xì)胞可行性，建立有效誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞向肝細(xì)胞分化的培養(yǎng)體系。 方法： 用RT—PCR檢測(cè)pou5f1基因的表達(dá)鑒定

5、E14小鼠胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell，ESCs)的未分化特性，然后常規(guī)培養(yǎng)增殖ESCs。誘導(dǎo)開始：傳代ESCs，消化成單細(xì)胞懸液后以1×104的密度種入6孔板，按誘導(dǎo)進(jìn)程依次添加：堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、丁酸鈉(sodium butyrate，SB)、骨形態(tài)形成蛋白—4(bone morphogenic protein—4，BMP—4)、肝

6、細(xì)胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)、制瘤素(oncostatin M，OSM)地塞米松(Dexamethasone，Dex)進(jìn)行分組誘導(dǎo)，整個(gè)誘導(dǎo)過程持續(xù)十六天。分化過程中用光學(xué)顯微鏡觀察各組細(xì)胞密度及形態(tài)學(xué)改變；RT—PCR檢測(cè)各組肝細(xì)胞特異性標(biāo)志基因白蛋白(albumin，ALB)、甲胎蛋白(α—fetoprotein，AFP)、甲狀腺素運(yùn)載蛋白(transthyretin，TTR)、α1抗胰蛋

7、白酶(α1-antitrypsin，AAT)、酪氨酸轉(zhuǎn)氨酶(tyrosine aminotransferase，TAT)、肝細(xì)胞核因3p(hepatocyte nuclearfactor3β，HNF3β)、肝細(xì)胞核因子4α(hepatocyte nuclear factor4α，HNF4α)、細(xì)胞角蛋白18(cytokeratin18，CK18)、細(xì)胞角蛋白19(cytokeratin19，CK19)、膽固醇7α—羥化酶A1(Chole

8、sterol7α—hydroxylaseA1，CYP7A1)的mRNA表達(dá)；免疫熒光化學(xué)分析檢測(cè)肝細(xì)胞特異性標(biāo)志蛋白ALB、AFP、CYP7A1、FⅧ、FⅨ的表達(dá)；通過糖原PAS染色試驗(yàn)和吲哚氰綠攝取試驗(yàn)檢測(cè)誘導(dǎo)分化的細(xì)胞是否具有肝臟細(xì)胞功能；透射電鏡觀察是否出現(xiàn)肝臟細(xì)胞樣的超微結(jié)構(gòu)。 將誘導(dǎo)7-8天的細(xì)胞按1:3比例消化傳代，傳代后繼續(xù)按原方案誘導(dǎo)，誘導(dǎo)過程結(jié)束后用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)算未經(jīng)消化傳代處理和經(jīng)消化傳代后細(xì)胞總數(shù)，RT—

9、PCR檢測(cè)消化傳代處理對(duì)于肝臟特定基因表達(dá)的影響。 結(jié)果： 1.分組誘導(dǎo)結(jié)果 1.1光鏡結(jié)果 1.1.1細(xì)胞密度 以1×104的密度種入6孔板，觀察發(fā)現(xiàn)從第二天開始D組和E組死亡細(xì)胞增多，第五天換液后，各孔均出現(xiàn)較多的死亡細(xì)胞，第六天，死亡細(xì)胞逐漸減少，經(jīng)過八天誘導(dǎo)后，D組和E組的細(xì)胞密度仍低于其他組，第九天改換含有HGF的培養(yǎng)液后，各皿又出現(xiàn)較多死亡細(xì)胞，但此時(shí)，各孔細(xì)胞均已鋪滿皿底，繼續(xù)誘導(dǎo)發(fā)

10、現(xiàn)，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長，細(xì)胞常由于密度過大，聚集成團(tuán)，有些團(tuán)塊內(nèi)部發(fā)黑。 1.1.2細(xì)胞形態(tài) 誘導(dǎo)開始，撤除LIF，加上各組誘導(dǎo)液，單個(gè)細(xì)胞逐漸由圓形或類圓形轉(zhuǎn)變成多角形，發(fā)生分化，第一天即可見D組和E組有多數(shù)細(xì)胞開始分化，分化細(xì)胞比例明顯多于其他組別，三天后，可見D組和E組細(xì)胞形態(tài)與其他組別相比，突起更長，第六天，各組均可見多角形細(xì)胞，第八天，A組、B組細(xì)胞類型較其他組別復(fù)雜，C組、D組和E組均可見有鋪路石狀排列緊密的

11、肝細(xì)胞樣細(xì)胞，但C組和E組的細(xì)胞均一性優(yōu)于D組。誘導(dǎo)至十四天后，細(xì)胞形態(tài)無明顯改變，但各組細(xì)胞均有空泡樣變，折光率下降。 1.2 RT—PCR結(jié)果 隨著誘導(dǎo)時(shí)間的推進(jìn)，標(biāo)志肝臟細(xì)胞發(fā)育過程的ALB、AFP、TTR、AAT、TAT、HNF3β、HNF4α、CYP7A1、CK18、CK19的mRNA表達(dá)量在各組間有較大差別。 1.3免疫熒光化學(xué)檢測(cè)結(jié)果 誘導(dǎo)分化細(xì)胞中的部分細(xì)胞ALB、AFP、CYP7A1、F

12、Ⅷ、FⅨ表達(dá)為陽性。 1.4功能檢測(cè)結(jié)果 誘導(dǎo)分化細(xì)胞具有糖原合成和吲哚氰綠攝取功能。 1.5電鏡結(jié)果 誘導(dǎo)分化細(xì)胞內(nèi)具有大量線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、糖原粒以及微絨毛等肝細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)。 2.消化傳代處理結(jié)果 2.1細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果 表2誘導(dǎo)16天后消化處理組和未經(jīng)消化處理細(xì)胞組細(xì)胞總數(shù)比較組別 第一組：消化處理組(3孔總數(shù))4.8×1064.65×1064.11×106

13、 第二組：未經(jīng)消化處理組(1孔數(shù))2.09×1061.96×1062.11×106 統(tǒng)計(jì)軟件采用SPSS13.0 for Windows，經(jīng)t檢驗(yàn)，P值小于0.01，消化傳代處理和未經(jīng)消化傳代處理細(xì)胞總數(shù)有顯著差異。 2.2 RT—PCR結(jié)果： 經(jīng)消化傳代后的細(xì)胞ALB、TTR、AAT、TAT、HNF3β、HNF4α、CK19的mRNA表達(dá)量均高于未經(jīng)消化處理的細(xì)胞。 結(jié)論： 1.加入丁酸鈉、bF