黃芩苷促進小鼠胚胎干細胞向功能性心肌細胞分化及其調控機制.pdf

1、背景:
　　胚胎干細胞(embryonic stem cells, ES細胞)是一類可進行自我更新的細胞,在一定條件下能夠向骨、軟骨、脂肪、肌肉、神經(jīng)等多個胚層的組織細胞分化。多項研究表明,ES細胞移植入缺血心臟后可以分化形成新生心肌細胞、血管內皮細胞等,還可以通過分泌多種生長因子,促進微循環(huán)建立,增加血流的灌注,提高梗死后心臟的功能。將ES細胞的多向分化特性應用于臨床治療,可能為心肌梗死后的慢性心力衰竭患者帶來新的希望。

2、　　ES細胞在體外培養(yǎng)條件下可以被誘導分化為心肌樣細胞,具備心肌細胞的表型,表達心肌特異性標志物,甚至有自發(fā)跳動現(xiàn)象。ES細胞源心肌細胞是再生醫(yī)學中治療心肌梗死導致的心力衰竭等心臟疾病的很有前景的細胞來源。但是ES細胞在體外自然分化為心肌樣細胞的效率很低,研究者已經(jīng)研究了用很多誘導因子在體外誘導ES細胞向心肌細胞分化,盡管取得了不少成就,但還是未能達到臨床移植治療心肌疾病所需要的細胞的數(shù)量和純度。如何進一步提高ES細胞源心肌細胞的分化率

3、以確保充足的心肌細胞來源是目前亟需解決的首要問題。尋找新的更有效、更安全、更經(jīng)濟的誘導劑仍是研究的熱點問題。傳統(tǒng)中藥的活性成分黃芩苷(baicalin)具有抗氧化、抗炎、保護缺血后受損的心肌細胞的作用,臨床上已經(jīng)廣泛運用于治療各種心血管疾病的治療。本課題旨在研究黃芩苷對體外培養(yǎng)的小鼠ES細胞(murine embryonic stem cells, mES細胞)向心肌細胞分化的作用及其調控機制。
　　胚胎干細胞分化是外界刺激和細胞

4、內特異性信號轉導通路調控的共同作用的結果。ES細胞向心肌細胞的分化過程類似胚胎時期的表現(xiàn),心肌發(fā)育相關調控基因在這一過程中會被激活,但其表達規(guī)律還有待進一步闡明。結合現(xiàn)有的中藥誘導 ES細胞向心肌細胞分化的研究現(xiàn)狀,我們希望通過使用黃芩苷誘導ES細胞向心肌細胞分化的實驗,試圖在以下幾個方面有所發(fā)現(xiàn):(1)黃芩苷能否誘導 mES細胞向心肌細胞分化?(2)在誘導后不同時間點心肌細胞的標志物表達有何差異?(3)黃芩苷在影響 ES細胞向心肌細胞

5、分化的過程中具體影響到了哪些調控心肌分化的信號通路?希望通過上述問題的研究闡明 ES細胞向心肌細胞分化的影響因素,為提高心肌細胞的分化比率提供理論依據(jù),加快ES細胞源心肌細胞在臨床上的應用進程。
　　目的:
　　1.觀察黃芩苷對mES細胞增殖的影響;
　　2.觀察黃芩苷對分化后不同時間點胚體生長的影響;
　　3.分別研究經(jīng)黃芩苷處理后不同分化時間點的心肌特異性標志物在 mRNA水平和蛋白水平的表達變化;
　

6、　4.研究調控心肌分化的各信號通路的相關基因在黃芩苷處理后不同分化階段的表達變化,揭示黃芩苷影響心肌分化的可能作用機制。
　　方法:
　　1.采用MTT(四甲基偶氮苯唑鹽)法檢測不同濃度的黃芩苷處理對 mES細胞增殖能力的影響,篩選最佳有效濃度用于誘導 mES細胞向心肌細胞分化。
　　2.mES細胞的體外誘導分化培養(yǎng):
　　采用經(jīng)典的“懸滴-懸浮-貼壁”三步法,持續(xù)用終濃度為10μmol/L和50μmol/L黃芩

7、苷誘導 mES細胞分化。每2天更換一次培養(yǎng)基,并保持分化過程中培養(yǎng)基始終維持相同的藥物濃度。
　　3.形態(tài)學觀察:
　　鏡下觀察 mES細胞克隆的形態(tài)。誘導分化后,用倒置顯微鏡連續(xù)觀測胚體(embryoid bodies,EBs)的直徑和含跳動區(qū)域的EBs數(shù)占總 EBs數(shù)的百分比。4.流式細胞檢測:
　　應用Phycoerythrin(PE)標記的抗體分別檢測分化第10、16、20天的EBs的心肌細胞占總細胞數(shù)的百分率

8、,即α-sarcomeric-actinin標記陽性細胞的百分率。
　　5.免疫熒光檢測:
　　分化第16天,用免疫熒光染色法檢測分化出的心肌樣細胞的心肌特異性的標志物α-肌小節(jié)輔肌動蛋白(α-sarcomeric-actinin)和心室肌特異性肌球蛋白輕鏈2(Myosin light chain-2,ventricular,MLC-2v)的表達。
　　6.逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)和實時熒光定量聚合酶鏈式反

9、應(real-time PCR)檢測:
　　分別在分化后第2、4、6、8、10、12、14、16、20天時提取樣本總 RNA,經(jīng)逆轉錄反應(RT)得到 cDNA,用3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)作為內參照基因,通過 RT-PCR和real-time PCR檢測三個胚層標志物如Sox17、PECAM和NCAM,心肌轉錄因子如Nkx2.5、MEF2c、TBX5、GATA4,心肌特異性基因如α-心肌肌球蛋白重鏈(Myosin hea

10、vy chain,α-MHC)、MLC-2v、心房鈉尿肽(atrial natriuretic peptide,ANP)和HCN4(hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channel4),及心肌發(fā)育調控信號通路相關基因如TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、BMP2、BMP4、Wnt11、Wnt3a的mRNA表達水平。
　　7.免疫印跡(western blo

11、t)檢測:
　　分別取分化第10、16、20天的胚體,提取細胞的總蛋白,經(jīng)過 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)蛋白分離、轉膜、蛋白印跡、ECL顯色曝光等步驟,檢測心肌特異性標志蛋白α-actinin、MLC-2v的表達。
　　8.膜片鉗記錄:
　　利用膜片鉗技術檢測干細胞來源的心肌細胞的電生理學特性和激素調節(jié)反應性。
　　結果:
　　不同濃度的黃芩苷對 mES細胞的增殖均有抑制作用,此抑制作用

12、呈濃度依賴性。在分化的過程中,黃芩苷處理組的EB直徑顯著小于對照組。但是50μmol/L黃芩苷明顯地提高了mES細胞向心肌細胞的分化比例,表現(xiàn)在:(1)黃芩苷提高了中晚期跳動胚體的比例。(2)黃芩苷提高了α-actinin陽性細胞的比例。(3)分化中后期,心肌特異性標志物α-MHC、MLC-2v及ANP的mRNA水平在黃芩苷組的表達明顯高于對照組。免疫熒光結果顯示在對照組和黃芩苷處理組得到的mES細胞來源的心肌細胞中都有心肌特異性的蛋白

13、α-actinin和MLC-2v的表達。膜片鉗記錄結果顯示分化出來的心肌細胞中存在著起搏樣細胞、心房樣細胞、心室樣細胞。黃芩苷處理組中的心房及心室樣心肌細胞的比例高于空白對照組,起搏樣細胞的比例低于對照組。除了起搏樣細胞和心室樣細胞的跳動頻率在黃芩苷組高于對照組外,其他的動作電位參數(shù)在兩組間沒有明顯的差異。黃芩苷誘導出的心肌細胞具有了完整的激素調節(jié)功能。檢測的心肌轉錄因子中,僅有Nkx2.5在分化晚期被黃芩苷上調,其他轉錄因子的表達未明

14、顯受到黃芩苷處理的影響。黃芩苷在分化中期上調Wnt3a的表達,然而在分化晚期,黃芩苷則明顯地抑制了Wnt3a的表達,黃芩苷對檢測的其他調控心肌發(fā)育的基因mRNA水平?jīng)]有產生明顯的影響。
　　結論:
　　1.黃芩苷抑制mES細胞的增殖,此抑制作用具有濃度依賴性。
　　2.黃芩苷(50μmol/L)可以促進mES細胞分化為心肌細胞,此促進作用主要表現(xiàn)在分化晚期。
　　3.黃芩苷促進mES細胞向心房肌和心室肌細胞分化,