γ-分泌酶抑制劑DAPT對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化影響及可能機(jī)制.pdf

1、γ-分泌酶抑制劑DAPT對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化影響及可能機(jī)制 目的 采用體外培養(yǎng)的大鼠腦神經(jīng)干細(xì)胞(neuralstemcell，NSCs)，了解γ-分泌酶抑制劑DAPT對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞分化和增殖能力的影響，檢測(cè)Notch通路的信號(hào)分子基因表達(dá)的情況以及明確與Notch信號(hào)調(diào)控相關(guān)的蛋白質(zhì)分子及其他與NSCs生物學(xué)特性相關(guān)的蛋白質(zhì)，探討DAPT調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞增殖和生長(zhǎng)的可能機(jī)制。 方法 1．采用無血清神經(jīng)球培養(yǎng)

2、法，從出生2-3d的大鼠腦皮質(zhì)分離培養(yǎng)NSCs，用免疫熒光細(xì)胞染色方法對(duì)培養(yǎng)4周的NSCs進(jìn)行自我更新能力、特異性標(biāo)志和多向分化能力等方面的鑒定，并將證實(shí)為NSCs的細(xì)胞用于本研究的實(shí)驗(yàn)。 2．經(jīng)200nmol／L的DAPT處理后的NSCs，用RT-PCR法檢測(cè)Notch通路信號(hào)分子(包括RBP-JK，HES1)的表達(dá)情況。 3．用CCK-8法和細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)在200nmoI／LDAPT作用下NSCs的增殖速率。

3、 4．200nmol／L的DAPT處理后的NSCs經(jīng)l％胎牛血清誘導(dǎo)72h后，用免疫熒光染色結(jié)合細(xì)胞計(jì)數(shù)的方法，觀察其分化為神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞的比例。 5．200nmol／L的DAPT處理后的NSCs經(jīng)1％胎牛血清誘導(dǎo)72h后，提取細(xì)胞總蛋白，用雙向電泳法分離蛋白，并選取與對(duì)照組表達(dá)顯著差異的蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜分析，明確與Notch信號(hào)調(diào)控相關(guān)的蛋白質(zhì)分子及其他與NSCs生物學(xué)特性相關(guān)的蛋白質(zhì)。 結(jié)果

4、 1．從新生大鼠腦皮質(zhì)分離的細(xì)胞在本研究的培養(yǎng)系統(tǒng)中呈神經(jīng)球懸浮生長(zhǎng)，抗Nestin和BrdU抗體免疫熒光染色均呈陽性，經(jīng)誘導(dǎo)可分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞。 2．RT-PCR法顯示200nmol／LDAPT作用后，細(xì)胞Notch信號(hào)分子RBP-JK和HESl的表達(dá)均減少，表明200nmol／LDAPT使Notch信號(hào)通路受到抑制。 3．CCK-8法檢測(cè)和細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果均顯示200nmol／LDAPT可抑制N

5、SCs的增殖。 4．200nmol／LDAPT后的NSCs分化發(fā)生變化，與對(duì)照組相比，神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞的比例增加，分別由(3．7±1．039)％和(4．8±1．216)％，上升為(13．84±1．221)％和(14．75±1．578)％，而星形膠質(zhì)細(xì)胞的比例由(82．84±3．681)％下降為(63．4l±1．202)％。 5．蛋白質(zhì)雙向電泳結(jié)果表明，分離的蛋白質(zhì)點(diǎn)主要集中在等電點(diǎn)4～7、相對(duì)分子質(zhì)量20000～l5

6、0000區(qū)域，與對(duì)照組相比表達(dá)差異11個(gè)蛋白中，有2個(gè)表達(dá)下調(diào)，9個(gè)上調(diào)。經(jīng)質(zhì)譜鑒定，這些差異表達(dá)的蛋白分別屬于轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子、G蛋白偶聯(lián)受體、離子通道蛋白和神經(jīng)微絲蛋白等。 結(jié)論 從新生大鼠腦皮質(zhì)分離培養(yǎng)出的神經(jīng)干細(xì)胞在200nmol／L的y-secretase抑制劑DAPT處理后，Notch通路受到抑制，下游的信號(hào)分子RBP-JK和HESl的表達(dá)均減少；NSCs的增殖受到抑制，分化發(fā)生變化，神經(jīng)元和少突膠