葉酸對大鼠腸神經(jīng)干細胞增殖分化的影響及機制研究.pdf

1、目的:
　　葉酸對中樞神經(jīng)干細胞的增殖和分化有明顯影響，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育、功能修復起重要作用。腸神經(jīng)干細胞在生物學特性上與腦神經(jīng)干細胞有許多相似性又存在差異，葉酸對其作用如何尚不明確。本研究從孕14天(E14)SD胎鼠的消化道提取腸神經(jīng)干細胞進行體外培養(yǎng)，并進行葉酸干預實驗，探討葉酸對其增殖、分化、凋亡的影響及可能的機制，為將來進行腸神經(jīng)元發(fā)育缺陷性疾病干細胞移植治療的研究提供理論依據(jù)。
　　方法:
　　1.從

2、孕14天SD胎鼠消化道提取腸神經(jīng)干細胞，運用改良腸神經(jīng)干細胞培養(yǎng)法，反復傳代培養(yǎng)。
　　2.觀察獲得的腸神經(jīng)干細胞形態(tài)，并經(jīng)干細胞特異性標記物Nestin、Tuj-1、GFAP及Brdu進行細胞免疫學鑒定。
　　3.實驗分組:將傳代腸神經(jīng)干細胞分為7組:①對照組(Control);②4μg/ml葉酸組(Folate-4);③40μg/ml葉酸組(Folate-40);④100μg/ml葉酸組(Folate-100);⑤400

3、μg/ml葉酸組(Folate-400);⑥DMSO+40μg/ml葉酸組(Folate+DMSO);⑦U0126+DMSO+40μg/ml葉酸組(Folate+U0126)。
　　4.CCK-8法繪制細胞生長曲線:分別于24h、48h、72h、96h、120h五個時間點用酶標儀測量上述分組中腸神經(jīng)干細胞在450nm處的OD值。
　　5.各組腸神經(jīng)干細胞培養(yǎng)48小時后，流式細胞儀檢測各組細胞中Nestin、BrduTuj-1

4、及GFAP染色陽性細胞的百分比。
　　6.各組腸神經(jīng)干細胞培養(yǎng)48小時后，流式細胞儀檢測各組細胞的凋亡率。
　　7.各組腸神經(jīng)干細胞培養(yǎng)48小時后，用Western-blot法檢測各組總ERK1/2及磷酸化ERK1/2的蛋白表達量。
　　結果:
　　1.從孕14天胎鼠消化道提取的原代細胞3-4天即能形成典型的神經(jīng)球，并顯示Nestin、Brdu標記蛋白陽性，經(jīng)血清誘導分化的細胞GFAP、Tuj-1顯陽性，證明提取

5、到的原代細胞為腸神經(jīng)干細胞。
　　2.腸神經(jīng)干細胞進行傳代培養(yǎng)后，經(jīng)CCK-8法測得各組(24h、48h、72h、96h、120h)S個時間點的OD值隨著時間的增加而升高，同一時間點隨著葉酸濃度的遞增OD值也相應升高，F(xiàn)olate-100組達到最大，5個時間點的OD值分別為(0.60±0.13，0.78±0.19，0.96±0.23，1.05±0.22，1.14±0.18)，與其它各濃度組相比均有明顯差異(P＜0.05)，F(xiàn)ola

6、te-400組OD值有所下降。Folate+U0126與Folate+DMSO組相比，F(xiàn)olate+U0126各個時間點的OD值(分別為0.38±0.15，0.42±0.21，0.53±0.23，0.70±0.19，0.74±0.20)顯著低于Folate+DMSO組(0.53±0.15，0.68±0.22，0.93±0.26，1.03±0.19，1.06±0.20)(P＜0.05)，提示隨著抑制劑U0126的加入，葉酸對腸神經(jīng)干細胞增

7、殖的促進作用顯著減弱。
　　3.傳代培養(yǎng)48小時后，流式檢測結果顯示，與對照組相比，F(xiàn)olate-4、Folate-40和Folate-100葉酸組Nestin及Brdu陽性細胞百分比隨濃度遞增，F(xiàn)olate-100葉酸組達最高，分別為(84.26±8.0)％和(44.23±1.40)％，與其它各濃度組比較P＜0.05，而Folate-400葉酸組比值下降。Folate+U0126與Folate+DMSO組相比Nestin及Brd

8、u陽性細胞百分率下降明顯(P＜0.05)。
　　4.流式結果示Folate-100葉酸組Tuj-1陽性細胞百分比為(66.60±8.63)％,相比對照組顯著增加(P＜0.05)，F(xiàn)olate-4及Folate-40葉酸組也有所增加，但無統(tǒng)計學意義。Folate+U0126組Tuj-1陽性細胞百分比為(39.40±7.99)％，與Folate+DMSO組比較，下降顯著(P＜0.05)。
　　5.流式檢測結果示除Folate-4

9、葉酸組外，其余各濃度組GFAP陽性細胞百分比同對照組相比均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，其中Folate-100葉酸組GFAP陽性細胞百分比為(55.83±5.15)％，顯著高于對照組(P＜0.05)，且與Folate-4、Folate-400組相比存在差異(P＜0.05); Folate+U0126組GFAP陽性細胞百分比為(27.03±1.57)％，與Folate+DMSO組相比，下降顯著(P＜0.05)。
　　6.流式檢測各

10、組細胞凋亡率，與對照組相比，除Folate-400組外，其余各組均無顯著性差異(P＜0.05)，F(xiàn)olate-400組為(12.39±4.85)％，相較于對照組顯著升高(P＜0.05); Folate+U0126與Folate+DMSO組比較，前者細胞凋亡率為(14.64±5.00)％,顯著升高(P＜0.05)。
　　7.Western-blot結果示，和對照組相比Folate-4、Folate-40、Folate-100和Fol

11、ate-400組磷酸化ERK1/2蛋白表達量均有增加，F(xiàn)olate-100組表達量最高，其相對灰度值為(0.85±0.14)％，除Folate-400組外，與其它各濃度組比較均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。Folate+U0126組磷酸化ERK1/2蛋白表達量為(0.54±0.07)％,與Folate+DMSO組相比明顯下降，有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　結論:
　　1.本實驗可成功從SD胎鼠消化道中提取腸神經(jīng)干細胞，

12、所得神經(jīng)球強陽性表達Nestin、Brdu，誘導分化后的神經(jīng)元Tuj-1染色陽性、神經(jīng)膠質(zhì)細胞表達GFAP，說明得到的細胞為腸神經(jīng)干細胞。
　　2.適當濃度的葉酸可促進體外腸神經(jīng)干細胞的增殖和分化;濃度過高其增殖和分化作用減弱，并可能誘導細胞凋亡。
　　3.ERK1/2特異性抑制劑U0126能通過抑制ERK1/2信號通路來影響腸神經(jīng)干細胞的增殖分化過程，并促進其凋亡。提示ERK1/2信號通路在葉酸調(diào)節(jié)大鼠腸神經(jīng)干細胞增殖分化