補(bǔ)腎治法對(duì)腎虛大鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞增殖機(jī)制的研究.pdf

1、目的:
　　本研究從在體實(shí)驗(yàn)方面展開(kāi)，通過(guò)建立腎虛大鼠模型并用補(bǔ)腎治法進(jìn)行干預(yù)，從動(dòng)物行為學(xué)、組織形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)等多角度多層面，觀察腎虛大鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞的增殖變化情況和補(bǔ)腎治法的干預(yù)作用，探討腎主藏精的功能與海馬神經(jīng)干細(xì)胞增殖的內(nèi)在關(guān)系，以及補(bǔ)腎治法對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化作用機(jī)制，并為中醫(yī)藥結(jié)合現(xiàn)代干細(xì)胞技術(shù)在治療臨床重大疑難疾病提供理論與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:
　　一、理論研究
　　通過(guò)對(duì)相關(guān)文獻(xiàn)的梳理，討

2、論中醫(yī)腎主藏精與干細(xì)胞的增殖分化的關(guān)系及影響神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化的因素。
　　二、實(shí)驗(yàn)研究
　　采用單純房室不節(jié)（雌雄比例5∶1合籠30天）、長(zhǎng)期房室不節(jié)（雌雄比例2∶1合籠6個(gè)月）、“房室不節(jié)，勞倦過(guò)度”（雌雄比例5∶1合籠，并結(jié)合1小時(shí)強(qiáng)迫游泳，30天）及灌胃腺嘌呤不同造模方法制備腎虛大鼠模型。通過(guò)觀察Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)及組織形態(tài)學(xué)等指標(biāo)變化，評(píng)價(jià)不同造模方法制備的腎虛大鼠模型質(zhì)量，為進(jìn)一步研究提供理想的腎虛動(dòng)物模型。

3、觀察補(bǔ)腎治法對(duì)腎虛模型大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力及海馬組織形態(tài)學(xué)的影響;補(bǔ)腎治法對(duì)腎虛模型大鼠海馬DG區(qū)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)及增殖凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響;補(bǔ)腎治法對(duì)腎虛模型大鼠海馬DG區(qū)細(xì)胞β-catenin、Wnt1、CyclinD1和c-Myc表達(dá)的影響。
　　結(jié)果:
　　一、理論研究
　　中醫(yī)腎主藏精與干細(xì)胞的增殖分化存在相關(guān)性，補(bǔ)腎方藥對(duì)干細(xì)胞的增殖和分化均有一定的干預(yù)效應(yīng)。
　　二、實(shí)驗(yàn)研究
　?。ㄒ唬┭a(bǔ)腎治

4、法對(duì)單純房室不節(jié)腎虛大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響
　　Morris水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)中，組間兩兩比較，與正常對(duì)照組比較，腎虛模型組潛伏期明顯延長(zhǎng)(P＜0.01，P＜0.05);與腎虛模型組比較，艾灸腎俞穴組潛伏期明顯縮短（P＜0.05）;與艾灸腎俞穴組比較，六味地黃丸低劑量組和六味地黃丸高劑量組大鼠逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)(P＜0.01，P＜0.05)?？臻g探索實(shí)驗(yàn)中，大鼠入水后前20s，與正常對(duì)照組相比，腎虛模型組穿越原平臺(tái)區(qū)域次數(shù)和

5、平臺(tái)周?chē)鷧^(qū)域一時(shí)間均有所減少，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與腎虛模型組比較，六味地黃丸高劑量組大鼠穿越原平臺(tái)區(qū)域次數(shù)明顯提高（P＜0.05），艾灸腎俞穴組雖有所增長(zhǎng)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，六味地黃丸高劑量組和艾灸腎俞穴組大鼠平臺(tái)周?chē)鷧^(qū)域一時(shí)間均明顯提高（P＜0.05）;與六味地黃丸低劑量組比較，六味地黃丸高劑量組和艾灸腎俞穴組穿越原平臺(tái)區(qū)域次數(shù)和平臺(tái)周?chē)鷧^(qū)域一時(shí)間明顯延長(zhǎng)(P＜0.01，P＜0.05)。
　　（二）補(bǔ)腎治法對(duì)長(zhǎng)期房室不節(jié)腎虛大鼠

6、海馬DG區(qū)細(xì)胞生長(zhǎng)變化的影響1.Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　定位航行實(shí)驗(yàn)中與正常對(duì)照組比較，腎虛模型組潛伏期明顯延長(zhǎng)（P＜0.01）;與腎虛模型組比較，其余各干預(yù)組潛伏期明顯縮短(P＜0.01，P＜0.05);各干預(yù)組間無(wú)顯著性差異。空間探索實(shí)驗(yàn)中，入水后20s和60s內(nèi)，與正常對(duì)照組相比，腎虛模型組原平臺(tái)所在象限停留時(shí)間和平臺(tái)周邊區(qū)域一停留時(shí)間明顯減少(P＜0.01，P＜0.05);與腎虛模型組相比，金匱腎氣丸高劑量組平臺(tái)所

7、在象限停留時(shí)間和平臺(tái)周邊區(qū)域一停留時(shí)間明顯增加（P＜0.05）。入水后60s內(nèi)，六味地黃丸低劑量組平臺(tái)周邊區(qū)域一停留時(shí)間明顯增加（P＜0.05）;與金匱腎氣丸高劑量組相比，金匱腎氣丸低劑量組和艾灸腎俞穴組平臺(tái)周邊區(qū)域一停留時(shí)間明顯減少(P＜0.01，P＜0.05)。
　　2.各組大鼠海馬DG區(qū)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化電鏡檢測(cè)結(jié)果
　　腎虛模型組大鼠海馬DG區(qū)發(fā)生細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)損傷，主要表現(xiàn)為神經(jīng)微絲和微管結(jié)構(gòu)有明顯的溶解，線粒體發(fā)生明

8、顯的空泡變性。各干預(yù)組海馬DG區(qū)發(fā)生細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)損傷不同程度的減輕。其中，以金匱腎氣丸高劑量組情況最佳。
　　3.各組大鼠海馬DG區(qū)免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果
　　與正常對(duì)照組比較，腎虛模型組大鼠海馬DG區(qū)細(xì)胞β-catenin、NeuN、PCNA表達(dá)均明顯減少(P＜0.01，P＜0.05)，TUNEL表達(dá)均明顯增加，與腎虛模型組比較，艾灸腎俞穴組大鼠海馬DG區(qū)細(xì)胞NeuN、PCNA表達(dá)均明顯增加（P＜0.05），其余各用藥組大鼠

9、海馬DG區(qū)細(xì)胞β-catenin、NeuN、PCNA表達(dá)均明顯增加(P＜0.01，P＜0.05)，TUNEL表達(dá)均明顯減少(P＜0.01，P＜0.05);高劑量組療效優(yōu)于低劑量組，藥物組療效優(yōu)于艾灸組。
　　（三）補(bǔ)腎治法對(duì)“房室不節(jié)，勞倦過(guò)度”腎虛大鼠海馬DG區(qū)細(xì)胞生長(zhǎng)變化的影響1.Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　定位航行實(shí)驗(yàn)中，與正常對(duì)照組比較，腺嘌呤組和腎虛模型組潛伏期明顯延長(zhǎng)(P＜0.01);與腎虛模型組比較，六味地

10、黃丸組和金匱腎氣丸組潛伏期明顯縮短（P＜0.01，P＜0.05）;與腺嘌呤組比較，腺嘌呤加藥組潛伏期明顯縮短（P＜0.05）;與六味地黃丸組比較，金匱腎氣丸組潛伏期差異，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。空間探索實(shí)驗(yàn)中，與正常對(duì)照組相比，腺嘌呤組和腎虛模型組大鼠站臺(tái)穿越次數(shù)、平臺(tái)周邊區(qū)域一停留時(shí)間和路程明顯減少(P＜0.01);與腎虛模型組相比，金匱腎氣丸組大鼠站臺(tái)穿越次數(shù)、平臺(tái)周邊區(qū)域一停留時(shí)間和路程明顯增加(P＜0.01，P＜0.05)，六味地黃丸組大

11、鼠站臺(tái)穿越次數(shù)和路程明顯增加（P＜0.05）;與腺嘌呤組相比，腺嘌呤加藥組站臺(tái)穿越次數(shù)、平臺(tái)周邊區(qū)域一停留時(shí)間和路程明顯增加（P＜0.05）。
　　2.各組大鼠腎、睪丸組織形態(tài)學(xué)改變
　　腎虛模型組和腺嘌呤組大鼠腎臟和睪丸存在明顯的組織形態(tài)學(xué)損傷。腎虛模型組可見(jiàn)腎皮質(zhì)中腎小管中可見(jiàn)明顯紅染的透明管型，間質(zhì)血管充血明顯，局部有明顯的炎性病變，周?chē)醒仔约?xì)胞浸潤(rùn)。腺嘌呤組大鼠腎臟存在更嚴(yán)重的組織形態(tài)學(xué)損傷，主要表現(xiàn)為腎單位明顯減

12、少，腎小管擴(kuò)張呈網(wǎng)狀，腎小管上皮細(xì)胞變成扁平狀，有些腎小管中可見(jiàn)膿液，里面含有炎性細(xì)胞和壞死的細(xì)胞碎片，間質(zhì)中可見(jiàn)明顯的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。各干預(yù)組腎臟的組織形態(tài)學(xué)損傷均有不同程度的減輕。腎虛模型組和腺嘌呤組大鼠睪丸曲精細(xì)管明顯的萎縮，腔內(nèi)生精細(xì)胞明顯減少，甚至壞死。各干預(yù)組睪丸的組織形態(tài)學(xué)損傷均有不同程度的減輕。
　　3.各組大鼠腎、睪丸免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果
　　各組大鼠睪丸免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果可見(jiàn)，與正常對(duì)照組比較，腎虛模型組

13、和腺嘌呤組大鼠睪丸細(xì)胞β-catenin表達(dá)明顯減少(P＜0.01)，PCNA表達(dá)雖有減少，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，TUNEL表達(dá)均明顯增加（P＜0.01）;與腎虛模型組比較，六味地黃丸組和金匱腎氣丸組大鼠睪丸細(xì)胞β-catenin和PCNA表達(dá)均明顯增加（P＜0.01），TUNEL表達(dá)均明顯減少(P＜0.01);與腺嘌呤組比較，腺嘌呤加藥組大鼠睪丸細(xì)胞β-catenin表達(dá)明顯增加（P＜0.01），PCNA表達(dá)雖有增加，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

14、，TUNEL表達(dá)均明顯減少（P＜0.01）;與六味地黃丸組比較，金匱腎氣丸組各項(xiàng)表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　各組大鼠腎臟免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果可見(jiàn)，與正常對(duì)照組比較，腺嘌呤組大鼠腎臟PCNA表達(dá)明顯減少(P＜0.01)，β-catenin表達(dá)雖有減少，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，腎虛模型組和腺嘌呤組TUNEL表達(dá)均明顯增加(P＜0.01);與腎虛模型組比較，六味地黃丸組β-catenin表達(dá)均明顯增加(P＜0.01)，金匱腎

15、氣丸組雖有增加，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，六味地黃丸組和金匱腎氣丸組TUNEL表達(dá)均明顯減少(P＜0.01);與腺嘌呤組比較，腺嘌呤加藥組大鼠腎臟β-catenin和表達(dá)明顯增加(P＜0.01)，TUNEL表達(dá)均明顯減少(P＜0.01)。
　?。ㄋ模┭a(bǔ)腎法對(duì)腎虛大鼠海馬DG區(qū)細(xì)胞Wnt信號(hào)通路相關(guān)蛋白的影響
　　1.各組海馬DG區(qū)組織Western-blotting結(jié)果
　　與正常對(duì)照組比較，腎虛模型組和腺嘌呤組Wnt1、β

16、-catenin、c-Myc及CyclinD1蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯降低（P＜0.05）;與腎虛模型組比較，六味地黃丸組和金匱腎氣丸組Wnt1、β-catenin、c-Myc及CyclinD1蛋白相對(duì)表達(dá)明顯升高(P＜0.05，P＜0.01)，與腺嘌呤組比較，腺嘌呤加藥組Wnt1、β-catenin、c-Myc及CyclinD1蛋白相對(duì)表達(dá)明顯升高(P＜0.05，P＜0.01)。
　　2.各組海馬DG區(qū)Real-time PCR檢測(cè)結(jié)

17、果
　　與正常對(duì)照組比較，腎虛模型組和腺嘌呤組β-catenin mRNA、CyclinD1 mRNA和c-Myc mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯降低（P＜0.05，P＜0.01），Wnt1 mRNA相對(duì)表達(dá)量雖有降低，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;與腎虛模型組比較，六味地黃丸組和金匱腎氣丸組Wnt1mRNA、β-catenin mRNA、c-Myc mRNA及CyclinD1 mRNA相對(duì)表達(dá)明顯升高（P＜0.05，P＜0.01）;與腺嘌呤組比較，腺

18、嘌呤加藥組β-catenin mRNA、c-Myc mRNA及CyclinD1mRNA相對(duì)表達(dá)明顯升高(P＜0.05，P＜0.01)。
　　結(jié)論:
　?。ㄒ唬╅L(zhǎng)期房室不節(jié)、房室不節(jié)結(jié)合勞倦過(guò)度及灌胃腺嘌呤均可制作理想的腎虛大鼠模型，今后可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)操作需要和研究重心的不同，進(jìn)行選擇。
　　（二）補(bǔ)腎治法可改善腎虛大鼠空間學(xué)習(xí)記憶障礙、海馬DG區(qū)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)及組織形態(tài)學(xué)病變。
　?。ㄈ┭a(bǔ)腎方藥促進(jìn)腎虛大鼠海馬DG

19、區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞增殖，其作用機(jī)制可能是上調(diào)腎虛大鼠海馬DG區(qū)細(xì)胞Wnt1表達(dá)，激活經(jīng)典Wnt信號(hào)通路，導(dǎo)致胞內(nèi)β-catenin大量聚集，上調(diào)下游靶基因c-Myc和CyclinD1表達(dá)，啟動(dòng)靶基因轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)海馬神經(jīng)干細(xì)胞增殖。
　?。ㄋ模┲嗅t(yī)腎精與海馬神經(jīng)干細(xì)胞可能存在某種程度上的聯(lián)系，腎主藏精的功能體現(xiàn)在促進(jìn)干細(xì)胞的增殖，補(bǔ)腎治法可能通過(guò)激活經(jīng)典Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控干細(xì)胞的增殖。
　　創(chuàng)新點(diǎn):
　?。ㄒ唬┨岢鲂碌募僬f(shuō):