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1、目的:觀察淫羊藿苷(icariin,ICA)對體外培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞增殖的影響,并探討其可能的作用機(jī)制。
方法:采用原代培養(yǎng)的新生大鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞,并測定其增殖。于第3天分別給予不同濃度的ICA(50、100、200μM)孵育12 h后,使用5-溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)標(biāo)記分裂增殖的細(xì)胞,于第7天收集細(xì)胞待測。首先,采用免疫熒光法檢測神經(jīng)干細(xì)胞巢蛋白(Nestin)的表達(dá);BrdU免疫熒光法檢測神經(jīng)干細(xì)胞的增殖能力
2、;形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)手段檢測神經(jīng)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞;其次,細(xì)胞計數(shù)儀檢測神經(jīng)干細(xì)胞的數(shù)目;BrdU免疫熒光檢測ICA對神經(jīng)干細(xì)胞的增殖情況;最后,實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time RT-PCR)檢測細(xì)胞周期基因Cyclin D1和p21 mRNA的表達(dá);Western Blot檢測Cyclin D1蛋白的表達(dá)。
結(jié)果:1.神經(jīng)干細(xì)胞的鑒定:(1)形態(tài)學(xué)觀察:體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)干細(xì)胞懸浮聚集生長,呈不規(guī)則的
3、圓形或桑葚狀細(xì)胞集落,球體透亮,邊緣清晰、有荊棘狀突起,立體感強(qiáng);(2)神經(jīng)干細(xì)胞巢蛋白(Nestin)表達(dá)陽性;(3)神經(jīng)干細(xì)胞增殖能力(BrdU)表達(dá)陽性;(4)神經(jīng)干細(xì)胞分化能力:神經(jīng)元(NSE)表達(dá)陽性和星型膠質(zhì)細(xì)胞(GFAP)表達(dá)陽性;2.ICA明顯增加神經(jīng)干細(xì)胞的個數(shù);3.ICA促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞內(nèi)BrdU陽性的表達(dá);4.ICA明顯增高神經(jīng)干細(xì)胞Cyclin D1和p21 mRNA的表達(dá);5.ICA明顯增高神經(jīng)干細(xì)胞Cyclin
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