Wnt3a影響大鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞增殖、分化的體外研究.pdf

1、研究目的：
　　研究Wnt3a對(duì)大鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞增殖、分化的作用。
　　研究方法：
　　1.胎鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、分化及鑒定：采用機(jī)械分離、無血清選擇性連續(xù)傳代培養(yǎng)法從孕14天SD大鼠胚胎海馬組織中獲得神經(jīng)干細(xì)胞（neural stem cells，NSCs）。運(yùn)用熒光免疫細(xì)胞化學(xué)染色的方法檢測(cè) NSCs特異性標(biāo)志物巢蛋白（Nestin）以及胞膜蛋白Wnt3a受體(卷曲蛋白, Fzd3)的表達(dá)情況，并進(jìn)一步

2、對(duì)NSCs的多向分化潛能進(jìn)行鑒定。
　　2. Wnt3a影響神經(jīng)干細(xì)胞增殖的體外研究：取培養(yǎng)4天的神經(jīng)干細(xì)胞，依據(jù)培養(yǎng)液的不同將其分為對(duì)照組、bFGF組、Wnt3a組及bFGF+Wnt3a組，觀察記錄四組細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。細(xì)胞培養(yǎng)7天后使用Brdu標(biāo)記處于分裂增殖期的神經(jīng)干細(xì)胞，并以之作為評(píng)估NSCs增殖程度的指標(biāo)，用于后續(xù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　3. Wnt3a影響神經(jīng)干細(xì)胞分化的體外研究：依據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)液中是否添加Wnt3a分別

3、設(shè)立Wnt3a組和對(duì)照組，對(duì)其培養(yǎng)14天后誘導(dǎo)分化。使用熒光免疫細(xì)胞化學(xué)染色法計(jì)算出對(duì)照組和Wnt3a組中NSCs向神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細(xì)胞分化的比例，并以之作為評(píng)估NSCs分化趨勢(shì)的指標(biāo)，用于后續(xù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　研究結(jié)果：
　　1.神經(jīng)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、分化及鑒定：采用機(jī)械分離從孕14天SD大鼠胚胎大腦海馬組織中獲取的神經(jīng)干細(xì)胞，經(jīng)無血清培養(yǎng)基選擇性連續(xù)傳代培養(yǎng)能夠大量增殖。熒光免疫細(xì)胞化學(xué)染色法證實(shí)我們培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞

4、能夠表達(dá)特異性標(biāo)志物Nestin蛋白以及胞膜蛋白Wnt3a受體Fzd3，并具有分化為神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞的潛能。
　　2. Wnt3a影響神經(jīng)干細(xì)胞增殖的體外研究：四組NSCs培養(yǎng)7天后均呈抱團(tuán)樣懸浮性生長(zhǎng)，在倒置相差顯微鏡下對(duì)比觀察四組細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)照組NSCs克隆球數(shù)目和體積較其余三組明顯減少，而bFGF組克隆球體積較Wnt3a組增大，但兩組間克隆球數(shù)目未見明顯差異。bFGF+Wnt3a組克隆球數(shù)目較其余三組明顯增

5、多，而體積和bFGF組相比未見明顯差異。使用Brdu對(duì)上述四組細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各組細(xì)胞Brdu陽性率分別為：14.8％、27.2%、38.6%、54.5%，四組細(xì)胞間兩兩比較的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　3. Wnt3a影響神經(jīng)干細(xì)胞分化的體外研究：兩組細(xì)胞誘導(dǎo)分化24h后可見部分NSCs發(fā)出細(xì)小突起，隨著分化時(shí)間的延長(zhǎng)，胞體增大、突起數(shù)目逐漸增多。7天后細(xì)胞分化趨于穩(wěn)定，對(duì)其進(jìn)行 GFAP、β-Tubulin

6、-Ⅲ熒光免疫化學(xué)染色鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)照組、Wnt3a組 GFAP陽性率分別為68.42％±5.54％、56.20％±4.82％，而β-Tubulin-Ⅲ陽性率分別為8.54％±0.48％、11.25％±0.62％，對(duì)照組和 Wnt3a組間GFAP、β-Tubulin-Ⅲ陽性率差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　研究結(jié)論：
　　1.從孕14天SD大鼠胚胎海馬組織中獲得的神經(jīng)干細(xì)胞，具有自我更新能力，可分化為神經(jīng)元及星形