調(diào)肝治法影響慢性應(yīng)激大鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞分化機制的研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目的:
  近年來生活壓力的增加使人們長期處于慢性應(yīng)激狀態(tài),慢性心理應(yīng)激損傷已成為威脅人們身心健康的超級隱患,精神類疾病抑郁癥則是其中一種。慢性心理應(yīng)激導(dǎo)致海馬神經(jīng)干細(xì)胞受損,從而影響學(xué)習(xí)記憶功能,相關(guān)疾病已成為生物學(xué)研究界的重要課題。
  中醫(yī)藏象學(xué)理論認(rèn)為肝主疏泄,肝通過疏通功能、調(diào)節(jié)全身氣機,使臟腑經(jīng)絡(luò)之氣、血的運行通暢無阻,維持人體的正常情志活動。情志與“肝主疏泄”的功能密切相關(guān),其功能正常與否在人體情緒及精神活動中

2、扮演著非常重要的角色。肝主疏泄的實質(zhì)內(nèi)涵在于條暢全身氣機的流暢,調(diào)節(jié)人體精、氣、神、血、水的正常運轉(zhuǎn),肝的疏泄功能是人體臟腑功能活動的基本形式的概括。中醫(yī)認(rèn)為情志失常引起機體氣血運行失常,陰陽失衡是情志因素導(dǎo)致疾病發(fā)生的基本病機,而氣血運行失常與現(xiàn)代病理生理學(xué)中心理應(yīng)激理論關(guān)于疾病的認(rèn)識有很多相似之處,二者對不良情緒誘導(dǎo)或引發(fā)疾病的內(nèi)在機制有許多相似之處。肝失疏泄所致肝郁多由長期情志不暢所致。臨床表現(xiàn)以精神抑郁、萎靡不振、胸悶脅脹、不思

3、飲食、失眠多夢、多疑善慮、悲傷欲哭、善長太息為主癥,這些癥狀與慢性心理應(yīng)激抑郁相似。慢性心理應(yīng)激與中醫(yī)肝藏象的疏泄功能,特別是情志內(nèi)郁導(dǎo)致肝失疏泄、氣機郁滯密切相關(guān)??梢哉J(rèn)為,肝郁即肝失疏泄是慢性應(yīng)激抑郁癥發(fā)病的重要環(huán)節(jié)。臨床上肝郁證所表現(xiàn)出的全身應(yīng)激反應(yīng)的失調(diào),實際是神經(jīng)內(nèi)分泌免疫功能的失調(diào),這可能是慢性應(yīng)激抑郁癥和肝失疏泄之肝郁證共同的病理學(xué)基礎(chǔ)。因此認(rèn)為慢性心理應(yīng)激屬于中醫(yī)情志病因的范疇。
  研究已經(jīng)證實,肝主疏泄條暢情志

4、的功能不僅對HPA軸有調(diào)節(jié)作用,而且對中樞神經(jīng)機制有調(diào)節(jié)作用。疏肝解郁法治療心理應(yīng)激性病變,已被大量研究成果證實是一種有效的療法,肝主疏泄能改善慢性應(yīng)激抑郁模型大鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞的損傷,改善情緒活動及學(xué)習(xí)記憶能力。疏肝方藥四逆散通過激活Wnt信號通路,促進海馬中的神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化。本團隊前期研究發(fā)現(xiàn),四逆散能促使Wnt1、β-catenin的高水平表達,激活經(jīng)典Wnt信號通路,促進NSCs的增殖與分化。四逆散能明顯提高Wnt5a和

5、JNK的表達量,激活非經(jīng)典Wnt信號通路,認(rèn)為在NSCs層面上,肝主疏泄主要表現(xiàn)為促進NSCs的遷移與分化。對比干細(xì)胞(SCs)與中醫(yī)先天之精起源、作用和發(fā)展規(guī)律,許多學(xué)者從多個角度發(fā)現(xiàn)這兩種物質(zhì)在人體中的作用相似,通過干細(xì)胞這一視角對先天之精和腎是先天之精的內(nèi)涵進行了討論,干細(xì)胞的生理功能與中醫(yī)的先天之精十分相似,體內(nèi)干細(xì)胞存在的形式與先天之精在體內(nèi)存在形式也類似。干細(xì)胞是一類具有自我更新、高度增殖和多分化潛能的細(xì)胞,具有無限分裂能力

6、,能分化成多種細(xì)胞,包括神經(jīng)干細(xì)胞。慢性心理應(yīng)激影響海馬神經(jīng)干細(xì)胞的增殖與分化,疏肝解郁法治療心理應(yīng)激性病變,已被大量研究成果證實是一種有效的療法,尤其是改善應(yīng)激反應(yīng)對海馬的損傷。
  慢性心理應(yīng)激損傷屬于中醫(yī)情志內(nèi)傷病因的范疇,中醫(yī)藏象理論認(rèn)為,肝主疏泄調(diào)暢氣機對于調(diào)節(jié)人體的情志活動具有重要意義。因此,從海馬神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化角度研究肝主疏泄對慢性心理應(yīng)激損傷海馬的機制研究,從細(xì)胞水平深入闡明肝主疏泄內(nèi)涵,豐富中醫(yī)肝藏象及情志病

7、因理論,討肝腎藏泄互用關(guān)系的實質(zhì),并為應(yīng)用調(diào)肝治法結(jié)合干細(xì)胞技術(shù)在臨床上治療重大疑難疾病提供理論與實驗依據(jù)。
  方法:
  取8周齡、SPF級、雄性、wistar成年大鼠為研究對象,采用慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激(電擊、夾尾、禁食、束縛、禁水、冰水游泳,傾斜,燥濕)建立慢性心理應(yīng)激大鼠模型。觀察疏肝方藥四逆散對慢性心理應(yīng)激大鼠的體重,反映快感缺失的糖水消耗實驗,反映活動度和空間探索能力的曠場試驗及反映學(xué)習(xí)記憶能力的水迷宮實驗的影

8、響;通過電鏡觀察疏肝方藥四逆散對慢性心理應(yīng)激大鼠海馬DG區(qū)突觸數(shù)量及結(jié)構(gòu)變化;通過Westen-blot和RT-PCR方法,觀察疏肝方藥四逆散對慢性心理應(yīng)激大鼠的海馬DG區(qū)與海馬神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化相關(guān)的Wnt信號通路中β-catenin、JNK、Rho信號蛋白表達及β-catenin、Wnt3a、Wnt11、Wnt5a、JNK、Rho基因表達的影響。
  結(jié)果:
 ?。ㄒ唬┧哪嫔β詰?yīng)激抑郁模型大鼠行為學(xué)的影響
  

9、1.體重:30d統(tǒng)計結(jié)果與15d一致??瞻捉M體重增長明顯大于其余造模組(P<0.05)。
  2.糖水消耗實驗:造模30d,空白組、氟西汀組、四逆散低劑量組糖水偏愛率高于模型組(P<0.05)。
  3.曠場試驗:①造模15d::空白組總路程、平均速度、中央?yún)^(qū)停留時間高于模型組(P<0.05)。②造模30d,空白組、氟西汀組、四逆散中劑量組運動總路程、平均速度、中央?yún)^(qū)停留時間、中央?yún)^(qū)路程高于模型組(P<0.05)
  

10、4.水迷宮實驗:定向航行潛伏期時間、空間探索120s穿越平臺次數(shù)無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。
 ?。ǘ┧哪嫔qRDG區(qū)突觸數(shù)量和超微結(jié)構(gòu)的影響
  電鏡觀察海馬DG區(qū)的超微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn),空白組可見大鼠海馬的突觸體數(shù)量多、突觸結(jié)構(gòu)大,細(xì)胞器如線粒體、高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等結(jié)構(gòu)清晰,突觸后致密物相對較厚,神經(jīng)細(xì)胞之間樹突形成,在樹突中可見大量微管結(jié)構(gòu),沒有線粒體發(fā)現(xiàn)空泡變性。模型組在與空白組比較,樹突中神經(jīng)微絲和微管結(jié)構(gòu)有明顯的溶

11、解,突觸數(shù)量明顯較少,突觸結(jié)構(gòu)明顯變小,線粒體發(fā)生明顯的空泡變性,細(xì)胞器結(jié)構(gòu)不清晰。氟西汀組與模型組比較樹突微管結(jié)構(gòu)清晰,突觸量多且無線粒體空泡,細(xì)胞器結(jié)構(gòu)清晰。四逆散低劑量組圖中可見神經(jīng)細(xì)胞之間形成的樹突,樹突之間形成的突觸結(jié)構(gòu)數(shù)量明顯減少,突觸結(jié)構(gòu)變短,部分樹突中微絲明顯減少,出現(xiàn)空染區(qū)域,有些線粒體水腫,內(nèi)嵴變短。四逆散中劑量組圖中可見神經(jīng)細(xì)胞之間形成的樹突,樹突間形成的突觸,突觸數(shù)量有些減少,突觸結(jié)構(gòu)明顯變小,可見線粒體,沒有發(fā)

12、現(xiàn)線粒體空泡變性。四逆散高劑量組神經(jīng)細(xì)胞間形成的樹突,樹突間形成的突觸,突觸數(shù)量增大,突觸結(jié)構(gòu)變大,可見線粒體,有些線粒體有少量發(fā)生空泡變性,水腫不明顯。
 ?。ㄈ┧哪嫔qRDG區(qū)β-catenin、Wnt3a、Wnt11、Wnt5a、JNK、Rho基因表達的影響
  1.Wnt11:空白組、氟西汀組、四逆散低劑量組與模型組比較表達升高(P<0.05)。
  2.Wnt5a:空白組、氟西汀組,四逆散低劑量組與模型組

13、比較表達升高(P<0.05)。
  3.Wnt3a:氟西汀組,四逆散低、中、高劑量組與模型組比較表達升高(P<0.05)。
  4.JNK:其余五組與模型組比較表達皆升高(P<0.05)。
  5.Rho:空白組、氟西汀組、四逆散中劑量組與模型組比較表達升高(P<0.05)。
  6.β-catenin:氟西汀組、四逆散中劑量組與模型組比較表達升高(P<0.05)。
 ?。ㄋ模┧哪嫔qRDG區(qū)JNK、Rh

14、o、β-catenin蛋白表達的影響
  1.JNK:空白組、氟西汀組、四逆散低劑量組與模型組比較表達升高(P<0.05)。
  2.Rho:空白組、氟西汀組、四逆散中劑量組與模型組比較表達升高(P<0.05)。
  3.β-catenin:氟西汀組、四逆散中劑量組與模型組比較表達升高(P<0.05)。
  結(jié)論:
 ?。ㄒ唬┧哪嫔β詰?yīng)激抑郁模型大鼠行為學(xué)的影響
  無論是西醫(yī)抗抑郁藥氟西汀,還是

15、中醫(yī)的疏肝解郁方藥四逆散都不能逆轉(zhuǎn)這種因慢性應(yīng)激致使體重增長緩慢的情況;四逆散低、高劑量組能改善因慢性應(yīng)激造成的大鼠快感缺失、興趣減退的抑郁癥狀;慢性應(yīng)激達到一定的時間和程度,導(dǎo)致大鼠興奮性降低,對大鼠的活動度和探索行為均造成影響,調(diào)肝中藥四逆散可這種抑郁癥狀,但不同劑量的四逆散改善這種抑郁癥狀時也不完全相同,表明肝主疏泄功能可改善因慢性應(yīng)激出現(xiàn)的一些抑郁癥狀。慢性心理應(yīng)激對學(xué)習(xí)記憶的及大鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞的損傷跟時間和程度有關(guān),可能跟使

16、用的造模方法、環(huán)境、鼠種等也有一定的關(guān)系。
 ?。ǘ┧哪嫔qRDG區(qū)突觸數(shù)量和超微結(jié)構(gòu)的影響
  本研究結(jié)果可表明,具有疏肝解郁功效的四逆散,無論低、中、高劑量,都能改善慢性應(yīng)激抑郁模型大鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞的損傷,增加突觸數(shù)量、改善突觸超微結(jié)構(gòu)的損傷,而四逆散中、高劑量組,特別是高劑量組效果更明顯。在促進海馬神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化方面,四逆散高劑量組則效果更佳。認(rèn)為肝主疏泄在神經(jīng)干細(xì)胞的增殖分化中,主要是表現(xiàn)為促進分化。<

17、br> ?。ㄈ┧哪嫔qRDG區(qū)β-catenin、Wnt3a、Wnt11、Wnt5a、JNK、Rho基因和蛋白表達的影響
  四逆散不同劑量對基因和蛋白表達的調(diào)控雖略有不同,但并無統(tǒng)計學(xué)差異,表明四逆散對Wnt通路上相關(guān)基因和蛋白的調(diào)控與劑量無關(guān)。四逆散可促進海馬神經(jīng)干細(xì)胞的分化,其促進分化的機制可能通過激活和調(diào)控的Wnt通路,促使β-catenin、Wnt3a、Wnt11、Wnt5a、JNK、Rho基因上調(diào),促使β-cate

18、nin、JNK、Rho基因和蛋白表達的上調(diào),從而提高了海馬神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化的比例。肝主疏泄可部分逆轉(zhuǎn)慢性應(yīng)激造成的海馬損傷,通過應(yīng)用疏肝藥四逆散可改善因慢性應(yīng)激造成的海馬神經(jīng)干細(xì)胞減少,促進海馬神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化。而對于肝腎藏泄互用的關(guān)系對神經(jīng)干細(xì)胞的增殖分化的調(diào)控實質(zhì),主要是體現(xiàn)促進神經(jīng)干細(xì)胞的分化。
  創(chuàng)新點:
 ?。ㄒ唬┨岢黾僬f:在細(xì)胞層面上,認(rèn)為中醫(yī)藏象理論中主要藏于腎的先天之精與干細(xì)胞相關(guān),而肝藏象中肝

19、主疏泄的功能能促使能促使海馬中神經(jīng)干細(xì)胞的分化,肝腎藏泄互用中肝主疏泄的功能不僅是對生殖之精的疏泄,也表現(xiàn)在對神經(jīng)干細(xì)胞的增殖分化的影響,在激活Wnt通路中,主要以激活非經(jīng)典通路促進海馬神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化。
 ?。ǘ┩ㄟ^wistar大鼠的在體動物實驗,從神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化的調(diào)控角度來探討肝主疏泄、腎主藏精及肝腎藏泄互用關(guān)系的實質(zhì),為拓展中醫(yī)藏象理論的研究提供了新的思路。
  存在的問題與展望:
  主要通過慢性應(yīng)

20、激抑郁模型即肝郁模型,結(jié)合前期團隊的體外實驗對海馬神經(jīng)干細(xì)胞分化進行了研究,未進行腎虛模型的在體實驗研究,藥物在體外環(huán)境與在體內(nèi)環(huán)境產(chǎn)生藥理效存在一定的差異,這是本實驗的缺陷。四逆散如何通過Wnt信號通路對海馬神經(jīng)干細(xì)胞進行調(diào)控,即它們對應(yīng)的機制還不甚清楚。所以,需要進一步研究Wnt信號通路,確定其組分的功能,四逆散對其組分的調(diào)控;四逆散為復(fù)方,起作用的為哪位藥物,藥物中的哪些成分,這些活性成分通過什么途徑調(diào)節(jié),這些對于有目的的干預(yù)神經(jīng)

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