丙烯酰胺對神經(jīng)干細胞的損傷及鈣蛋白酶抑制劑的干預.pdf

1、丙烯酰胺(acrylamide，ACR)是國際上確認的一種神經(jīng)毒物，其中毒患者主要是生產(chǎn)和使用單體的作業(yè)者，中毒表現(xiàn)尤其易出現(xiàn)在通風不良和缺乏個人防護的工作條件下。在ACR(如丙烯酰胺生產(chǎn)、聚丙烯酰胺合成、污水處理、石油開采、建筑工程灌漿等)的職業(yè)接觸人群中，職業(yè)性損害主要表現(xiàn)為皮膚損害以及神經(jīng)系統(tǒng)損害，神經(jīng)系統(tǒng)損害又包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CentralNervousSystem，CNS)和周圍神經(jīng)系統(tǒng)(PeriPheralnervousS

2、ystem，PNS)損害。90％的ACR單體用于生產(chǎn)聚丙烯酰胺(Polyaeryhmide，PACR)，近年來，石油工業(yè)發(fā)展迅速，PACR的需求量隨之不斷增加，因而ACR需求量隨之不斷增加，危害越來越大，對ACR的研究相應越來越多。但有關ACR神經(jīng)毒作用的細胞和分子機制尚未完全闡明。有學者認為ACR中毒是由軸漿運輸損傷引起的。細胞骨架在軸漿運輸中發(fā)揮著重要作用，ACR通過作用于軸突細胞骨架蛋白的不同成分而影響軸漿運輸，從而導致遠端軸突功

3、能改變，導致神經(jīng)損傷。而細胞骨架蛋白聚集或降解可能是由鈣離子依賴性蛋白酶(Calpain)對細胞骨架蛋白分解引起的。Calpain通過影響骨架蛋白在神經(jīng)系統(tǒng)的病理生理過程中發(fā)揮著重要作用。目前認為，CNS損傷后細胞內游離鈣離子水平升高，可增強Calpain活性，選擇性降解髓磷脂蛋白及多種細胞骨架蛋白。有學者應用免疫組化技術發(fā)現(xiàn)脊髓損傷后Calpain的表達增強。實驗中選擇神經(jīng)干細胞(neuralstemcells，NSCs)進行離體研究

4、，NSCs具有多向分化潛能，在研究神經(jīng)系統(tǒng)毒性時具有代表性;能進行自我增殖，可提供實驗所需的大量細胞。自出生24h內的Wistar新生大鼠脊髓背根神經(jīng)節(jié)(DorsalRootGanglion，DRG)獲取原代細胞并進行鑒定，獲取穩(wěn)定的細胞株。然后進行細胞ACR染毒，用噻唑蘭比色法(MTT)法測定吸光度值，計算細胞存活率以建立ACR對NSCs損傷的染毒模型，在此模型的基礎上用鈣蛋白酶抑制劑MDL-28170進行干預，建立干預模型。通過測定

5、細胞內鈣離子濃度及Calpain活性進一步確定鈣蛋白酶抑制劑對ACR誘發(fā)NSCs毒性的干預作用。
　　目的
　　1.本實驗建立ACR對NSCs的損傷模型，通過Calpain抑制劑MDL-28170抑制Calpain的活性達到抑制ACR引起的NSCs損傷的目的。
　　2.測定細胞內鈣離子濃度及Calpain活性，進一步確定ACR對NSCs的損傷及鈣蛋白酶抑制劑對這種損傷的干預作用，為后續(xù)研究神經(jīng)絲蛋白(Neurofila

6、ment，NF)變化機制、預防ACR暴露工人的NSCs損傷提供參考。
　　方法
　　1.無菌條件下摘取出生24h內新生大鼠的DRG，胰蛋白酶消化后進行接種，通過細胞免疫化學的方法檢測巢蛋白(nestin)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NeuronSpecificEnolase，NSE)、膠質纖維酸性蛋白(GlialFibrillaryAcidicProtein，GFAP)三個指標，以確認所培養(yǎng)細胞為NSCs。進行細胞的傳代培養(yǎng)，獲

7、取穩(wěn)定的細胞株。
　　2.對建立的細胞株進行ACR的染毒和MDL-28170干預劑量篩選，用MTT法測定吸光度值，計算細胞存活率來確定染毒劑量和染毒持續(xù)時間，建立細胞染毒及干預模型。
　　3.使用Fura-2/AM探針和calpainsubstratell分別測定細胞內鈣離子濃度及Calpain活性。
　　結果
　　1.原代細胞的獲取及鑒定
　　細胞免疫化學染色，NSCs的標志性蛋白Nestin染色呈陽性，

8、而且相同來源的細胞可誘導分化成NSE陽性的神經(jīng)元和GFAP陽性的膠質細胞。
　　2.染毒及干預模型的建立
　　(1)ACR的染毒濃度為0、1400、2800、4200、5600μmol/L，染毒24小時后，自2800μmol/LACR染毒組開始與對照組細胞存活率存在統(tǒng)計學差異（P＜0.05）;染毒48小時后，自1400μmol/LACR染毒組開始與對照組細胞存活率存在統(tǒng)計學差異(P＜0.05）。根據(jù)上述結果ACR24小時染毒

9、劑量調整為0、2240、2520、2800、3080μmol/L后，染毒后細胞存活率自2240μmol/LACR染毒組開始與對照組存在統(tǒng)計學差異(P＜0.05);48小時ACR染毒劑量調整為0、700、840、980、1120、1400μmol/L，染毒后細胞存活率自700μmol/LACR染毒組開始與對照組存在統(tǒng)計學差異(P＜0.05）。24小時染毒劑量為0、1050、1400、1750、2100μmol/L時，染毒后細胞存活率自21

10、00μmol/LACR染毒組開始與對照組存在統(tǒng)計學差異(P＜0.05);48小時染毒劑量調整為0、140、350、560、700μmol/L，染毒后細胞存活率自700μmol/LACR染毒組開始與對照組存在統(tǒng)計學差異(P＜0.05）。2100μmol/L染毒24小時與700μmol/L染毒48小時可定為實驗染毒劑量和染毒持續(xù)時間。
　　(2)ACR染毒的濃度和染毒持續(xù)時間分別為2100μmol/L染毒24小時與700μmol/L染

11、毒48小時，同時鈣蛋白酶抑制劑以65、130、195、260μmol/L的濃度進行干預。
　　24小時干預結果:所有染毒、干預組的細胞存活率均低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。65、130μmol/L干預組細胞存活率高于染毒組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);195、260μmol/L干預組細胞存活率低于染毒組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05）。
　　48小時干預結果:染毒、干預組的細胞存活率均低于對照組，差異

12、有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。65、130μmol/L干預組細胞存活率高于染毒組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);195μmol/L干預組細胞存活率與染毒組差異無統(tǒng)計學差異(P＞0.05);260μmol/L干預組細胞存活率低于染毒組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　3.細胞內鈣離子濃度測定結果
　　與對照組相比:染毒組的鈣離子濃度高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);干預組鈣離子濃度平均值高于對照組，但差

13、異沒有統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。與染毒組相比:干預組鈣離子濃度低于染毒組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　4.Calpain活性測定結果
　　與對照組相比:染毒組的Caipain活性高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);干預組Calpain活性高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05）。與染毒組相比:干預組Calpain活性低于染毒組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05）。
　　結論
　　1.成功