神經(jīng)源性絲氨酸蛋白酶抑制劑對(duì)腦出血致血腦屏障損傷的作用研究.pdf

1、自發(fā)性腦出血(Intracerebral hemorrhage，ICH)在我國(guó)占急性腦血管病的30％左右，急性期病死率約為30％～40％，是急性腦血管病中最高的，具有高發(fā)病率、高致殘率、高死亡率的特點(diǎn)。血腦屏障(Blood-brain barrier，BBB)損傷是腦出血后水腫形成的重要機(jī)制之一，而腦水腫是腦出血患者病情惡化和死亡的重要原因，控制腦水腫降低顱內(nèi)壓是腦出血治療的重點(diǎn)之一。
　　Zhang等人研究發(fā)現(xiàn)外源性神經(jīng)元性絲氨

2、酸蛋白酶抑制劑(Neuroserpin，NSP)能夠減少腦缺血后腦血管通透性的增加從而減少BBB損傷。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于NSP在缺血性卒中及癲癇等疾病中的神經(jīng)保護(hù)作用已有諸多研究，但罕有腦出血中NSP作用的相關(guān)研究，我們希望通過(guò)實(shí)驗(yàn)探討NSP在腦出血中對(duì)BBB的影響，尋找腦出血臨床治療的新策略。
　　本課題首先通過(guò)免疫熒光、Western blot觀察比較腦出血小鼠在干預(yù)后24h/48h/72h不同時(shí)間點(diǎn)血腫周邊腦組織NSP蛋白較空白

3、對(duì)照及假手術(shù)組表達(dá)變化情況，并分析其隨時(shí)間變化趨勢(shì);然后通過(guò)神經(jīng)功能缺損評(píng)分、干濕重法測(cè)定腦組織含水量、伊文思藍(lán)(Evans blue，EB)法檢測(cè)BBB通透性，研究腦出血后外源性皮質(zhì)注射N(xiāo)SP蛋白溶液相較單純腦出血組在24h/48h/72h各時(shí)間點(diǎn)是否減少BBB損傷從而減輕腦水腫，并分析其時(shí)間相關(guān)性;進(jìn)一步在干預(yù)后48h通過(guò)免疫熒光觀察腦出血后外源性注射N(xiāo)SP能否減輕BBB結(jié)構(gòu)破壞，通過(guò)Western blot檢測(cè)NSP干預(yù)后血腫周邊

4、區(qū)域BBB重要結(jié)構(gòu)蛋白o(hù)ccludin表達(dá)變化情況。本實(shí)驗(yàn)探討腦出血后NSP蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)，研究其在腦出血小鼠中對(duì)BBB的影響，并進(jìn)一步探究其對(duì)BBB作用的機(jī)制，為NSP對(duì)BBB影響提供理論依據(jù)，可能為腦出血的臨床治療提供新的策略。
　　第一部分:觀察腦出血后血腫周?chē)鶱SP蛋白表達(dá)及其隨時(shí)間變化情況
　　目的:觀察小鼠自體血注射法行腦出血造模后在24h/48h/72h不同時(shí)間點(diǎn)血腫周?chē)X組織NSP蛋白表達(dá)較空白對(duì)照組及假手術(shù)

5、組變化情況，并分析其隨時(shí)間變化趨勢(shì)。
　　方法:將C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、假手術(shù)組、腦出血組，腦出血組分為24h、48h、72h三個(gè)亞組。空白對(duì)照組小鼠不予任何處理直接處死，假手術(shù)組小鼠在建立假手術(shù)模型后24h處死，腦出血各亞組小鼠建立腦出血模型后在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)處死，所有小鼠處死前進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分。通過(guò)免疫熒光及Western blot法觀察腦出血小鼠在干預(yù)后24h/48h/72h不同時(shí)間點(diǎn)血腫周邊腦組織NSP蛋

6、白較空白對(duì)照及假手術(shù)組表達(dá)變化情況。
　　結(jié)果:1.神經(jīng)功能缺損評(píng)分結(jié)果顯示腦出血各亞組小鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分較空白對(duì)照組及假手術(shù)組均顯著升高(p＜0.01)，腦出血48h亞組較24h亞組神經(jīng)功能缺損評(píng)分顯著升高(p＜0.05)。2.免疫熒光結(jié)果顯示腦出血各亞組小鼠血腫周邊區(qū)域NSP蛋白表達(dá)較空白對(duì)照組及假手術(shù)組顯著升高，尤其在血腫淺部皮質(zhì)區(qū)域高表達(dá)最為明顯，腦出血48h組較明顯。3.Western blot結(jié)果顯示腦出血各亞組小鼠

7、血腫周邊區(qū)域NSP蛋白表達(dá)較空白對(duì)照組及假手術(shù)組顯著升高(p＜0.01)，腦出血48h組NSP表達(dá)均值最高，但腦出血各亞組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)論:1.腦出血后小鼠神經(jīng)功能受損。2.腦出血后小鼠血腫周邊區(qū)域組織NSP蛋白表達(dá)水平顯著升高，但隨時(shí)間變化趨勢(shì)不明顯。
　　第二部分:研究腦出血后外源性給予NSP對(duì)腦水腫及血腦屏障損傷程度的影響及其時(shí)間相關(guān)性
　　目的:研究小鼠腦出血后即刻予血腫淺部皮質(zhì)外源性注射N(xiāo)SP蛋白

8、溶液，相對(duì)假手術(shù)組和單純腦出血組小鼠在干預(yù)后24h/48h/72h不同時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)功能缺損、腦水腫及血腦屏障損傷程度變化情況，并分析其時(shí)間相關(guān)性。
　　方法:將C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、ICH組、ICH+NSP組，ICH組及ICH+NSP組各分為24h/48h/72h三個(gè)亞組，假手術(shù)組小鼠在建立假手術(shù)模型后24h處死，腦出血組小鼠建立腦出血模型，腦出血+NSP組小鼠建立腦出血模型后予外源性NSP注射，各組小鼠在干預(yù)后相應(yīng)

9、時(shí)間點(diǎn)處死，所有小鼠處死前進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分。通過(guò)干濕法測(cè)定腦組織含水量、EB法測(cè)定BBB通透性，評(píng)估不同時(shí)間點(diǎn)腦出血后外源性注射N(xiāo)SP對(duì)腦水腫及BBB損傷程度的影響。
　　結(jié)果:1.神經(jīng)功能缺損評(píng)分結(jié)果顯示ICH及ICH+NSP各亞組神經(jīng)功能缺損評(píng)分均較假手術(shù)組顯著升高(p＜0.01);ICH+NSP48h組較ICH48h組神經(jīng)功能評(píng)分顯著降低(p＜0.01);ICH+NSP72h組較ICH48h組神經(jīng)功能評(píng)分顯著降低(p＜0

10、.05); ICH+NSP24h組較ICH48h組神經(jīng)功能評(píng)分無(wú)顯著性差異(p=0.076)。2.腦組織含水量測(cè)定顯示ICH24h/48h/72h亞組及ICH+NSP48h/72h亞組腦組織含水量均較假手術(shù)組顯著升高(p＜0.01); ICH+NSP24h組較ICH24h組腦組織含水量顯著降低(p＜0.05); ICH+NSP48h/72h組較ICH48h/72h組腦組織含水量顯著降低(p＜0.01)。3.EB法測(cè)定BBB通透性顯示IC

11、H及ICH+NSP各亞組腦組織EB含量均較假手術(shù)組顯著升高(p＜0.01); ICH+NSP24h/48h亞組較ICH24h/48h亞組腦組織EB含量顯著降低(p＜0.01); ICH+NSP72h亞組較ICH72h亞組腦組織EB含量顯著降低(p＜0.05)。
　　結(jié)論:1.腦出血后小鼠神經(jīng)功能受損，腦出血后予血腫周皮質(zhì)外源性注射N(xiāo)SP在干預(yù)24h以后可見(jiàn)神經(jīng)功能缺損明顯減輕;2.腦出血后外源性給予NSP干預(yù)能夠明顯減少腦組織含水

12、量，即減輕腦水腫;3.腦出血后外源性給予NSP能夠明顯減少腦組織伊文思藍(lán)含量，即減少血腦屏障通透性。
　　第三部分:探討腦出血并外源性給予NSP后48h血腦屏障結(jié)構(gòu)蛋白o(hù)ccludin表達(dá)的變化情況
　　目的:研究小鼠腦出血后即刻予血腫淺部皮質(zhì)外源性注射N(xiāo)SP蛋白溶液，相對(duì)假手術(shù)組和單純腦出血組小鼠在干預(yù)后48h血腦屏障結(jié)構(gòu)蛋白o(hù)ccludin表達(dá)水平變化情況。
　　方法:將C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、腦出血

13、組、腦出血+NSP組。假手術(shù)組小鼠建立假手術(shù)模型，腦出血組小鼠建立腦出血模型，腦出血+NSP組小鼠建立腦出血模型后予外源性注射N(xiāo)SP，所有小鼠在干預(yù)后48h處死。通過(guò)免疫熒光觀察各組小鼠BBB結(jié)構(gòu)改變情況及occludin蛋白表達(dá)情況，并通過(guò)Western blot檢測(cè)正常紋狀體或血腫周邊腦組織occludin蛋白表達(dá)水平變化情況。
　　結(jié)果:1.免疫熒光結(jié)果顯示腦出血后小鼠血腦屏障結(jié)構(gòu)蛋白o(hù)ccludin表達(dá)較假手術(shù)組分布明顯紊

14、亂，微血管周occludin蛋白表達(dá)明顯減少，但總表達(dá)量未見(jiàn)明顯差異;腦出血+NSP組小鼠血腦屏障結(jié)構(gòu)蛋白o(hù)ccludin表達(dá)分布紊亂情況較腦出血組有好轉(zhuǎn)，微血管周occludin表達(dá)較單純腦出血組明顯增加，但總表達(dá)量未見(jiàn)明顯差異。2.Western blot結(jié)果顯示假手術(shù)組、腦出血組、腦出血+NSP組各組間血腫周邊區(qū)域occludin總蛋白表達(dá)水平無(wú)顯著差異(p＞0.05)。
　　結(jié)論:1.小鼠腦出血后血腫周邊區(qū)域血腦屏障結(jié)構(gòu)蛋

15、白o(hù)ccludin表達(dá)分布紊亂，微血管周occludin表達(dá)明顯減少，但總表達(dá)量未見(jiàn)明顯差異;腦出血后外源性給予NSP能夠在一定程度上改善occludin蛋白分布紊亂情況，使微血管周occludin蛋白表達(dá)明顯增加，但總表達(dá)量未見(jiàn)明顯差異。2.腦出血小鼠不論是否外源性給予NSP，血腫周邊區(qū)域組織occludin總蛋白表達(dá)水平均未見(jiàn)明顯改變。
　　總結(jié):小鼠腦出血后血腫周邊區(qū)域腦組織NSP蛋白表達(dá)水平升高，腦出血后即刻予外源性NSP