家蠶絲氨酸蛋白酶抑制劑serpin-3及相互作用蛋白研究.pdf

1、絲氨酸蛋白酶抑制劑超基因家族,參與調節(jié)生物體內多種生理反應。為深入研究絲氨酸蛋白酶抑制劑及互作因子在家蠶免疫防御中的作用機制,本文以家蠶為材料,做了如下研究:以脂肪體cDNA為模板克隆了家蠶絲氨酸蛋白酶抑制劑(serpin-3)基因。利用原核表達系統(tǒng)表達了Bmserpin-3的編碼區(qū),并純化了表達產物,利用純化的蛋白,研究了Bmserpin-3參與家蠶黑化作用的機理;采用His-pull down技術篩選了與家蠶 serpin-3相互作

2、用蛋白;用RNAi結合熒光定量 PCR的方法研究了Bmserpin-3對靶標蛋白的調控。主要研究結果如下：
　　⑴家蠶絲氨酸蛋白酶抑制劑serpin-3基因的克??；本實驗以家蠶幼蟲脂肪體cDNA為模板,擴增獲得了家蠶絲氨酸蛋白酶抑制劑serpin-3的基因序列(GenBank登錄號NP_001040318.1)?？寺〉募倚Qserpin-3基因開放閱讀框含1311 bp,編碼458個氨基酸,預測蛋白質分子量約為49.33 kD,等電

3、點約為5.28,信號肽是前22個氨基酸殘基,395-416是預測的活性位點,410位的Lys是預測的P1位點。
　?、萍倚Q絲氨酸蛋白酶抑制劑serpin-3基因的原核表達；將Bmserpin-3的編碼區(qū)克隆到表達載體pET-28a(+),轉化大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞,經0.5 mmol/L IPTG誘導進行原核表達。SDS-PAGE電泳分析表明,轉化了serpin-3重組載體的BL21菌,在約49 kD位置出現了特異性條帶,而對

4、照組BL21菌、空pET-28a(+)轉化的BL21菌、非誘導轉化去信號肽的pET-28a-Bmserpin-3重組菌與誘導轉化去信號肽的pET-28a-Bmserpin-3重組菌在同一位置則沒有出現此特異條帶,說明Bmserpin-3在大腸桿菌中得到表達,并對其進行了純化。
　?、羌倚Q絲氨酸蛋白酶抑制劑serpin-3參與黑化作用。家蠶serpin-3與果蠅、煙草天蛾、岡比亞按蚊參與黑化作用的serpin序列比對,發(fā)現它們的同源

5、性很高。用LPS誘導后不同時間分別測定serpin-3的蛋白濃度和PO活性,發(fā)現其濃度在LPS處理后較對照有所增加,PO活性升高,而在添加Bmserpin-3后,PO活性則有所降低,且隨著添加Bmserpin-3劑量的增加,其PO活性受抑制更明顯,說明Bmserpin-3抑制黑化作用。
　　⑷家蠶絲氨酸蛋白酶抑制劑serpin-3相互作用蛋白的研究。利用透析純化技術將獲得的原核表達重組融合蛋白進行純化,經SDS-PAGE檢測,純化

6、蛋白分子量大小與預測的一致,且目的蛋白純度很高,以此蛋白作為誘餌蛋白,用His pull-down方法篩選了與家蠶血液中serpin-3相互作用的蛋白,經質譜分析,相互作用蛋白為家蠶儲存蛋白(silkworm storage protein),性別特異儲存蛋白2(sex-specific storage-protein2 precursor),主要參與免疫,細胞凋亡等。
　?、杉倚Qserpin-3靶標蛋白的研究。設計3對siRNA

7、片段,轉染家蠶卵巢細胞BmN,篩選獲得干擾效果顯著的片段。并將有效片段轉染家蠶五齡第三天幼蟲后用熒光定量PCR方法檢測Bmsp2,3的表達量。結果顯示,經Bmserpin-3干擾后,Bmsp2表達量顯著下降,而Bmsp3表達量有所下降但不顯著。推測Bmserpin-3或許能通過降低Bmsp2的mRNA水平從而引起sp2蛋白水平下降,而Bmsp3在mRNA的水平變化不大,說明Bmserpin-3沒有影響B(tài)msp3的mRNA水平,可能在轉錄