家蠶絲氨酸蛋白酶抑制劑Serpin5多克隆抗體制備及組織表達(dá)分析.pdf

1、本研究以家蠶大造為材料，以脂肪體cDNA為模板克隆了家蠶絲氨酸蛋白酶抑制劑serpin-5基因，并進(jìn)行了序列分析。構(gòu)建了原核表達(dá)載體，獲得了重組的目的蛋白，以純化后的目的蛋白為抗原免疫昆明小鼠，制備了Serpin-5蛋白的多克隆抗體。采用此抗體分析了serpin-5在正常5齡3天的家蠶中腸、絲腺、脂肪體、馬氏管、精巢、卵巢，蛋白水平的組織表達(dá)。對(duì)家蠶BmN細(xì)胞和5齡3天家蠶進(jìn)行了RNAi研究，采用熒光定量PCR測(cè)定了干擾后目的基因在家蠶

2、幼蟲多個(gè)組織不同時(shí)段的轉(zhuǎn)錄水平。主要研究結(jié)果如下：
　　1.以反轉(zhuǎn)錄的家蠶5齡幼蟲脂肪體cDNA為模板，PCR擴(kuò)增獲得了Bmserpin-5基因序列。測(cè)序分析表明，克隆的目的基因serpin-5長(zhǎng)度為1140bp，編碼379個(gè)氨基酸殘基。預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為42.6kDa，等電點(diǎn)為6.02。目的基因（GeneBank登錄號(hào)：AY566165）是開(kāi)放閱讀框（ORF)去除信號(hào)肽的片段。用Signal P3.0 Server分析Bmse

3、rpin-5，推測(cè)其第1到第16個(gè)氨基酸殘基為信號(hào)肽序列。
　　2.將目的基因連接到原核表達(dá)載體pET-28a(+)上，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中，經(jīng)1mmol/L IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。重組菌液經(jīng)超聲波破碎、離心后獲得上清和沉淀，以誘導(dǎo)的空載體菌和未誘導(dǎo)的重組菌作為對(duì)照，進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。結(jié)果表明：在誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化去除信號(hào)肽的pET28a-serpin-5，超聲裂解后的沉淀中出現(xiàn)了一條約為43kDa特異性的蛋白條帶，

4、預(yù)測(cè)的成熟BmSerpin-5蛋白分子量約為42.6kDa，而超聲裂解后的上清中沒(méi)有出現(xiàn)特異性的條帶，表明去信號(hào)肽Bmserpin-5基因在大腸桿菌中得到成功表達(dá)并多以包涵體的形式存在。
　　3.誘導(dǎo)獲得大量的重組蛋白，采用鎳柱純化回收，獲得目的蛋白，以此為抗原免疫昆明小鼠，Western blot檢測(cè)制備的多克隆抗體具有較高的特異性，ELISA檢測(cè)該多抗對(duì)免疫抗原的效價(jià)達(dá)到1∶24000，特異性較好。
　　4.在制備高效價(jià)

5、抗體的基礎(chǔ)上，采用Western blot法檢測(cè)了BmSerpin-5蛋白在多個(gè)組織中的表達(dá)，結(jié)果表明在5齡第3天幼蟲精巢、卵巢中的表達(dá)量較高，中腸次之，在絲腺、馬氏管、脂肪體中的表達(dá)量較低。BmSerpin-5蛋白在生殖腺中的高表達(dá)，推測(cè)與家蠶的生殖生理相關(guān)。
　　5.在家蠶卵巢細(xì)胞BmN中對(duì)設(shè)計(jì)的siRNA片段進(jìn)行篩選，獲得干擾效果顯著的有效片段。有效片段轉(zhuǎn)染家蠶五齡第三天幼蟲后，用熒光定量PCR的方法測(cè)定精巢、卵巢、絲腺、脂

6、肪體、血液、表皮、馬氏管在24h，36h，48h后的轉(zhuǎn)錄表達(dá)特征。結(jié)果表明：與對(duì)照相比，在精巢、絲腺、脂肪體中mRNA的轉(zhuǎn)錄水平無(wú)明顯變化；在血液、表皮中48h時(shí)都降低了約3倍，卵巢中降低了約4倍，馬氏管中降低的最多，約9倍。干擾后測(cè)定血液中酚氧化酶的活性，發(fā)現(xiàn)酶的活性隨時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸升高，48h時(shí)升高了約1.5倍。干擾后，血液中的Bmserpin-5降低了3倍，酚氧化酶活性升高了1.5倍，推測(cè)Bmserpin-5與血液中的酚氧化酶存