家蠶絲氨酸蛋白酶抑制劑Serpin-6基因差異表達(dá)分析.pdf

1、本研究以家蠶(大造)為研究材料，首先采用半定量RT-PCR方法研究了家蠶在不同發(fā)育時(shí)期經(jīng)LPS(脂多糖)和Bt(蘇云金桿菌，Bacillus thuringiensis)刺激后Bm Serpin-6基因的轉(zhuǎn)錄水平變化，然后研究了家蠶從幼蟲到成蟲整個(gè)發(fā)育過程中不同階段BmSerpin-6基因的轉(zhuǎn)錄水平變化，最后采用Bac-to-Bac系統(tǒng)表達(dá)了BmSerpin-6蛋白，主要研究結(jié)果如下：
　　 (一)不同齡期的BmSerpin-6

2、在經(jīng)過兩種刺激物免疫刺激后轉(zhuǎn)錄水平都呈先上升后下降的趨勢(shì)，但轉(zhuǎn)錄水平上升至最高點(diǎn)的時(shí)間不一樣：其中LPS刺激四齡眠蠶6h BmSerpin-6轉(zhuǎn)錄水平最高，LPS刺激五齡起蠶9h BmSerpin-6轉(zhuǎn)錄水平最高；Bt刺激四齡眠蠶3h BmSerpin-6轉(zhuǎn)錄水平最高，Bt刺激五齡起蠶6h BmSerpin-6轉(zhuǎn)錄水平最高，Bt刺激五齡三天蠶9h BmSerpin-6轉(zhuǎn)錄水平最高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步說明了Bm Serpin-6基因與家蠶免疫

3、相關(guān)。4齡眠蠶、5齡起蠶和5齡3天蠶受刺激后Bm Serpin-6基因轉(zhuǎn)錄水平在前期都顯著上調(diào)；同一種刺激物刺激不同發(fā)育時(shí)期的家蠶，轉(zhuǎn)錄水平上升至最高點(diǎn)的時(shí)間不一樣，我們推測(cè)可能是由于不同發(fā)育時(shí)期的家蠶抗性水平不一致，受不同刺激物誘導(dǎo)家蠶生理代謝受影響的程度不一致。
　　 (二)BmSerpin-6基因在家蠶不同發(fā)育時(shí)期的轉(zhuǎn)錄水平具有明顯的時(shí)空特異性：
　　 (1)在各個(gè)起蠶期BmSerpin-6轉(zhuǎn)錄水平無明顯變化，但在

4、眠起過程中變化顯著，4齡眠蠶轉(zhuǎn)錄水平明顯高于五齡起蠶。
　　 (2)在家蠶五齡期不同發(fā)育時(shí)間轉(zhuǎn)錄水平有很大差異，BmSerpin-6在5齡1-3d的轉(zhuǎn)錄水平很低，5齡4d轉(zhuǎn)錄水最低，后逐漸升高，在5齡6d達(dá)到最高。
　　 (3)在熟蠶未吐絲前BmSerpin-6轉(zhuǎn)錄水平很高，在吐絲開始后降到最低，隨著吐絲時(shí)間的延長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄水平逐漸上升。
　　 (4)在蛹期BmSerpin-6轉(zhuǎn)錄水平隨著化蛹時(shí)間的延長(zhǎng)呈先上升后下降的

5、趨勢(shì)，在化蛹6d最高，化蛹13d最低。成蟲期BmSerpin-6轉(zhuǎn)錄水平與剛化蛹時(shí)接近。
　　 (5)BmSerpin-6基因在5齡期家蠶精巢和卵巢中的轉(zhuǎn)錄水平均呈先下降后上升的趨勢(shì)。
　　 由此看來，BmSerpin-6除了參與免疫反應(yīng)，可能還具有其它生理功能。
　　 (三)采用苜蓿銀蚊夜蛾Bac-to-Bac系統(tǒng)表達(dá)了BmSerpin-6蛋白。收集細(xì)胞進(jìn)行SDS-PAGE和Western Blot分析，結(jié)果在

6、46kD左右出現(xiàn)一條特異性條帶，與預(yù)計(jì)融合蛋白大小相符，說明目的蛋的得到了表達(dá)。為進(jìn)一步研究BmSerpin-6的功能打下了物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　 本文通過兩種誘導(dǎo)物刺激4齡眠蠶、5齡起蠶和五齡3d蠶，系統(tǒng)地研究了家蠶動(dòng)態(tài)發(fā)育過程中BmSerpin-6基因的轉(zhuǎn)錄水平與免疫刺激的關(guān)系，實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明BmSerpin-6基因轉(zhuǎn)錄水平受免疫刺激影響變化顯著，推測(cè)BmSerpin-6參與家蠶先天性免疫；通過對(duì)家蠶整個(gè)發(fā)育過程中不同階段BmSer