家蠶絲氨酸蛋白酶抑制劑基因Serpin-6的克隆、序列分析及表達(dá)研究.pdf

1、本研究以大造家蠶為材料，取5齡3天的家蠶頭部、中腸、脂肪體、絲腺、精巢、卵巢和血淋巴。以家蠶脂肪體cDNA為模板克隆家蠶絲氨酸蛋白酶抑制劑(Serpin-6)基因；以頭、中腸、脂肪體、絲腺、精巢、卵巢和血淋巴cDNA為模板做半定量分析。用脂多糖(LPS)刺激5齡3天家蠶后分時(shí)間段取其血淋巴和脂肪體，然后以其cDNA為模板做半定量分析。采用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行家蠶Serpin-6基因的表達(dá)研究。主要研究結(jié)果如下： 1.利用BL

2、AST程序，將昆蟲Serpin保守序列與家蠶EST數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，拼接后得到一段包含完整ORF的預(yù)測(cè)的家蠶Serpin序列；根據(jù)此序列設(shè)計(jì)合適的引物，采用RT-PCR方法以5齡3天大造家蠶脂肪體為材料提取mRNA，克隆了家蠶Serpin-6基因(GenBank登錄號(hào)：EU159447)。序列分析表明，家蠶Serpin-6基因編碼區(qū)長(zhǎng)度為1242bp，編碼413個(gè)氨基酸，相對(duì)分子量約為46.47kDa,等電點(diǎn)約為5.48，成熟蛋白質(zhì)的分子

3、量約為44.62kDa。與其他昆蟲的絲氨酸蛋白酶抑制劑同源比較發(fā)現(xiàn)該基因與煙草天蛾Serpin-6基因氨基酸序列的相似性最高，達(dá)77.67％，與岡比亞按蚊Serpin-9的次之，相似性為39.51％。而與家蠶Serpin-5的相似性只有22.37％。推測(cè)家蠶Serpin-6與煙草天蛾Serpin-6可能屬于直系同源基因，起著相同或類似的作用。將該基因全長(zhǎng)cDNA與家蠶基因組比對(duì)后發(fā)現(xiàn)該基因包括8個(gè)外顯子，7個(gè)內(nèi)含子。用SignalP3.

4、0Server程序分析家蠶Serpin-6基因，預(yù)測(cè)其N-末端第1到第17個(gè)氨基酸殘基為信號(hào)肽序列。 2.根據(jù)獲得的家蠶Serpin-6基因ORF序列，設(shè)計(jì)一對(duì)引物，進(jìn)行半定量RT-PCR反應(yīng)。以5齡3天大造家蠶幼蟲的頭、中腸、脂肪體、絲腺、精巢、卵巢和血淋巴及免疫刺激后不同時(shí)間段脂肪體和血淋巴cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物預(yù)期大小為349bp，以家蠶actin3基因?yàn)閮?nèi)參。1.2％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并進(jìn)行半定

5、量計(jì)算。結(jié)果表明，Serpin-6在家蠶頭部及6個(gè)組織中均有表達(dá)。在家蠶頭、精巢和卵巢中的表達(dá)量最高，在中腸和絲腺中的表達(dá)量次之，在脂肪體和血淋巴中的表達(dá)量最低。用LPS誘導(dǎo)5齡3天的家蠶，取不同時(shí)間段的脂肪體和血淋巴做半定量表達(dá)研究，結(jié)果表明，Serpin-6基，因在家蠶脂肪體中經(jīng)誘導(dǎo)后3h表達(dá)量上調(diào)，到6h時(shí)達(dá)到最高，之后逐漸下降。誘導(dǎo)后Serpin-6基因在家蠶血淋巴中的表達(dá)情況同誘導(dǎo)脂肪體一樣，誘導(dǎo)3h后該基因表達(dá)量呈上調(diào)趨勢(shì)，

6、在誘導(dǎo)后6h時(shí)，該基因的表達(dá)量達(dá)到最高，之后從6h到12h，24h逐漸下降，24h時(shí)降到該誘導(dǎo)組的最低。由此推測(cè)，家蠶Serpin-6基因具有免疫功能，另外，根據(jù)該基因在家蠶頭部及6個(gè)組織中的表達(dá)差異推測(cè)它或許還有其他的功能，這將有待更進(jìn)一步的研究。 3.將去掉信號(hào)肽的家蠶Serpin-6基因克隆進(jìn)原核表達(dá)載體pET-28a(+)，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中，經(jīng)1mmol/LIPTG誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)。SDS-PAGE電泳分

7、析結(jié)果表明，家蠶Serpin-6基因以融合蛋白形式表達(dá)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化去信號(hào)肽家蠶Serpin-6的BL21菌與對(duì)照BL21菌、空pET-28a(+)轉(zhuǎn)化BL21菌和非誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化去信號(hào)肽家蠶Serpin-6的BL21菌相比出現(xiàn)了一條特異性的蛋白質(zhì)條帶，相對(duì)分子量約45kDa，推測(cè)家蠶Serpin-6在大腸桿菌中得到表達(dá)。經(jīng)Westernblot分析表明在預(yù)測(cè)的約45kDa大小位置出現(xiàn)較明顯的條帶，與推導(dǎo)的融合蛋白分子量相符。而對(duì)照BL

8、21菌、空pET-28a(+)轉(zhuǎn)化BL21菌和非誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化家蠶Serpin-6的BL21菌都沒(méi)有檢測(cè)到條帶，進(jìn)一步證明了去信號(hào)肽家蠶Serpin-6在大腸桿菌中成功表達(dá)。而含有信號(hào)肽的家蠶Serpin-6在同樣的實(shí)驗(yàn)條件下，沒(méi)有檢測(cè)到特異性蛋白條帶。因此推測(cè)含有信號(hào)肽的家蠶Serpin-6在原核表達(dá)體系中不能成功表達(dá)可能是受其信號(hào)肽序列的影響。 家蠶Serpin-6基因的成功克隆、組織半定量表達(dá)、LPS刺激后在不同時(shí)間段的半定量表