雙歧桿菌絲氨酸蛋白酶抑制劑的克隆表達及功能的初步研究.pdf

1、雙歧桿菌是人體胃腸道的原籍菌和優(yōu)勢菌,通過與乳酸桿菌及其它厭氧菌一起共同占據(jù)腸粘膜表面,形成生物屏障,在維持腸道微生態(tài)平衡和促進宿主健康方面發(fā)揮了重要作用。黏附和免疫是雙歧桿菌發(fā)揮重要生理作用的基礎(chǔ),然而,有關(guān)其黏附腸上皮細胞的作用機制和參與免疫作用的物質(zhì)基礎(chǔ)仍不甚清楚。目前有關(guān)黏附和免疫的研究主要集中在雙歧桿菌的外膜蛋白上,而其中之一的Serine protease inhibitor(Serpin)蛋白,近三年引起了關(guān)注。
　

2、　 Serpin是一類多肽類的絲氨酸蛋白酶抑制劑的總稱,由350至500個氨基酸組成。在真核生物中,Serpin通過調(diào)節(jié)絲氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶的活性,參與纖溶、炎癥反應(yīng)、細胞遷移、分化以及凋亡等許多重要的生命活動。然而,有關(guān)原核生物中Serpin的功能作用的報道甚少。2006年瑞士雀巢研究中心發(fā)現(xiàn)長雙歧桿菌的Serpin蛋白可以有效抑制外源蛋白酶的活性,為雙歧桿菌黏附于腸道提供條件。為研究Serpin在不同種屬的雙歧桿菌中的分布

3、,從18株分屬兩歧雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌、短雙歧桿菌、長雙歧桿菌、青春雙歧桿菌、乳酸雙歧桿菌、動物雙歧桿菌的7個種的雙歧桿菌中克隆到3個serpin基因,分別來源于B.infantis WBAN07、B.bifidum WBBI02和B.longum NCC2705,序列同源性為99.9％。序列分析表明這3個serpin基因存在8個堿基差異,其中B.infantisWBAN07中的149位和770位的序列改變導致了在B.longum N

4、CC2705中組氨酸和谷氨酰胺均變成了精氨酸,而B.bifidum WBBI02中只有149位的堿基改變使得組氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榫彼帷?br>　　 鑒于B.bifidum WBBI02的高粘附力,本實驗重點對其Serpin的表達和生物學功能進行了初步研究,即從B.bifidum WBBI02克隆到去除兩端疏水區(qū)域的serpin基因,構(gòu)建原核表達載體pBX2-WBBI02。在25℃,0.2 mM IPTG誘導3-4小時的條件下獲得約32 kD

5、的可溶性Serpin蛋白,使用NTA His.Bind樹脂柱獲得純化的Serpin蛋白?；钚匝芯康某醪浇Y(jié)果表明:Serpin在體外能有效地抑制糜蛋白酶和胰彈性蛋白酶的活性,最高抑制率分別為90％和97％,顯微觀察結(jié)果證實Serpin能促進雙歧桿菌對HT-29細胞的粘附。
　　 Serpin克隆表達及其功能研究將為探討Serpin在不同益生菌(雙歧桿菌)中的功能和作用機制,奠定良好的試驗基礎(chǔ),也必將為分析雙歧桿菌其它細胞成分的黏附