豆?fàn)钅椅豺式z氨酸蛋白酶抑制劑(serpin)的克隆表達(dá)及酶活性研究.pdf

1、豆?fàn)钅椅豺什?Cysticercosis pisiformis)是由豆?fàn)顜Ы{蟲（Taenia pisiformis）的幼蟲豆?fàn)钅椅豺剩–ysticercus pisiformis）寄生于兔的肝臟、大網(wǎng)膜、腸系膜及腹腔內(nèi)引起的一種絳蟲病。豆?fàn)钅椅豺什∈羌彝酶腥韭瘦^高的常見寄生蟲病之一，對(duì)養(yǎng)兔業(yè)的健康發(fā)展和經(jīng)濟(jì)效益產(chǎn)生較大影響。絲氨酸蛋白酶抑制劑(serine protease inhibitor，serpin)是一類分子質(zhì)量在40～50k

2、Da的蛋白酶抑制劑，不僅參與調(diào)節(jié)寄生蟲內(nèi)源性生理功能，而且還在宿主-寄生蟲相互作用以及宿主的免疫調(diào)節(jié)或免疫逃避過程中發(fā)揮重要作用。因此，serpin被認(rèn)為是參與免疫調(diào)節(jié)和其他生物學(xué)過程的重要因子，有望作為寄生蟲病診斷、生物藥物及疫苗的候選靶標(biāo)。本研究在系統(tǒng)分析豆?fàn)钅椅豺蔆pserpin（Cysticercus pisiformis serpin，Cpserpin）基因及其表達(dá)特征的基礎(chǔ)上，探索了基于重組蛋白Cpserpin用于間接ELI

3、SA診斷豆?fàn)钅椅豺什〉目尚行?，并以真核表達(dá)的Cpserpin評(píng)價(jià)了對(duì)絲氨酸蛋白酶的抑制效果，為揭示Cpserpin的生物學(xué)功能，闡明其在豆?fàn)钅椅豺矢腥局械淖饔锰峁┝死碚撘罁?jù)。
　　1.利用RT-PCR和cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE)法獲得Cpserpin基因的全長cDNA序列，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明，Cpserpin的eDNA序列全長1471bp，其完整開放閱讀框(ORF)長為1149bp，且具有serpin家族保守

4、基序(DEEGAE)、標(biāo)簽序列(FKVDHPFIFFI)及特有的反應(yīng)中心環(huán)結(jié)構(gòu)域(RCL)等結(jié)構(gòu)特征。
　　2.成功構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pET30a(+)-Cpserpin，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)在大腸桿菌中表達(dá)了主要以包涵體形式存在的重組蛋白Cpserpin。Western-blotting檢測(cè)結(jié)果表明，Cpserpin可被兔豆?fàn)钅椅豺什￡栃匝遄R(shí)別。通過優(yōu)化反應(yīng)條件，以Cpserpin為包被抗原建立的間接ELISA方法對(duì)兔豆?fàn)钅椅豺什〉?/p>

5、敏感性和特異性分別可達(dá)96.7％和93.5％，且批間和批內(nèi)的變異系數(shù)均小于10％。表明Cpserpin有望作為豆?fàn)钅椅豺什≡\斷的候選抗原分子。
　　3.qPCR結(jié)果表明，Cpserpin在成熟節(jié)片中的轉(zhuǎn)錄水平較囊尾蚴階段提高了53倍。利用鎳珠瓊脂糖凝膠親和層析法純化的重組蛋白Cpserpin免疫新西蘭大白兔，經(jīng)3次免疫后，獲得了高滴度的特異性IgG抗體。免疫組化試驗(yàn)結(jié)果顯示，Cpserpin在囊尾蚴階段表達(dá)量很低，但在成節(jié)和孕節(jié)中

6、高度表達(dá)，且廣泛分布于蟲體體壁和蟲卵中，推測(cè)可能與寄生蟲逃避宿主的免疫攻擊、及攝取營養(yǎng)和生殖發(fā)育有關(guān)。
　　4.成功構(gòu)建了真核表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-Cpserpin，在畢赤酵母KM71中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE和Western-blotting結(jié)果表明，重組蛋白Cpserpin不僅能與標(biāo)簽抗體和兔豆?fàn)钅椅豺赎栃匝宸磻?yīng)，而且純度很高。用發(fā)色底物法分別檢測(cè)Cpserpin對(duì)α-糜蛋白酶、胰蛋白酶和彈性蛋白酶活性抑制效果的結(jié)果表