鯽魚肌原纖維結合型絲氨酸蛋白酶內源性抑制劑的研究.pdf

1、魚糜加工過程中發(fā)生的凝膠劣化現(xiàn)象是影響魚糜品質的重要因素。與海水魚相比,淡水魚魚糜加工更容易產生凝膠劣化。目前研究表明,魚肌肉中含有的肌原纖維結合型絲氨酸蛋白酶(MBSP)降解肌原纖維蛋白是造成魚糜凝膠劣化的主要原因。因此,尋找一種天然有效的MBSP抑制劑來防止魚糜的凝膠劣化,成為目前魚糜加工技術的另一方向。近年,從白姑魚肌肉中分離出一種內源性的肌原纖維結合型絲氨酸蛋白酶抑制劑(Myofibril-bound serine protei

2、nase inhibitor,MBSPD,且與豬的GPI具有高度的同源性。關于淡水魚MBSPI的研究尚未見報道,本研究以鯽魚為材料,研究其肌肉中MBSP的天然內源性抑制劑,并嘗試初步解釋二者之間的作用機理。
　　 本研究通過緩沖液抽提、酸沉淀、離子交換色譜、親和層析等方法從鯽魚肌肉肌原纖維中純化得到MBSP,并對其性質進行分析。純化MBSP的回收率為2.4％,純化倍數(shù)為600倍,MBSP對胰蛋白酶類底物都有不同程度降解,其中對B

3、oc-Gln-Arg-Arg-MCA降解最為顯著,對組織蛋白酶底物Z-Phe-Arg-MCA、氨肽酶底物Arg-MCA以及胰凝乳蛋白酶底物Suc-Leu-Leu-Val-Try-MCA與Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-MCA均不分解作用。抑制劑試驗結果顯示,絲氨酸蛋白酶抑制劑對MBSP有強烈抑制,E-64對MBSP有部分抑制。以上結果說明MBSP屬于胰蛋白酶類的絲氨酸蛋白酶。通過硫酸銨分級沉淀、Q-Sepharose離子交換層析

4、、Superdex200凝膠過濾層析得到純化,回收率為8.0％,純化倍數(shù)為468倍。通過凝膠過濾測定的分子量為120kDa,而在SDS-PAGE中,則檢測到2個不同的亞基(55kDa,65kDa),推測其為異源二聚體結構。通過LC-MS/MS高效液相-串聯(lián)質譜進行的肽指紋圖譜鑒定結果顯示,得到的肽段與斑馬魚gpia的同源性為91.7％,與gpib的同源性為97.5％。以果糖-6-磷酸(F-6-D)為底物時,GPI的Km=0.36mmol

5、/L，GPI的最適pH與溫度分別為8.5與50℃,且在pH8.0-9.5與40℃以下較穩(wěn)定。鯽魚GPI能特異抑制鯽魚MBSP活性,而對其它類型的絲氨酸蛋白酶以及白姑魚的MBSP沒有抑制作用。動力學實驗表明GPI對MBSP屬于可逆競爭型抑制,其Ki為0.075μmol/L。GPI對MBSP降解肌原纖維蛋白酶的抑制試驗顯示,GPI對肌原纖維的降解有較明顯的抑制作用,其中肌球蛋白重鏈(MHC)、肌動蛋白(Actin)、原肌球蛋白(Tropom