球毛殼菌絲氨酸蛋白酶基因克隆及原核表達研究.pdf

1、球毛殼菌（Chaetomium globosum）能侵染多種植物病原真菌，通過其體內產生和釋放不同的的水解酶類和抗生素物質來抑制真菌的生長。眾多的研究結果顯示：球毛殼菌（C.globosum）的各種酶能滲入到合適的宿主中并利用宿主的生物體作為營養(yǎng)來源進行生長，由于這樣的寄生作用，球毛殼菌（C.globosum）已被用于多種植物病原真菌的生物防治。多種證據表明球毛殼菌（C.globosum）能夠減少許多重要農業(yè)病原菌的發(fā)病率和危害范圍。球

2、毛殼菌（C.globosum）中一些與生物防治相關的基因已經被克隆出來，如幾丁質酶和木聚糖酶。然而，關于球毛殼菌（C. globosum）中在生物防治中起著重要作用的蛋白酶類的研究較少。
　　本研究從球毛殼菌（C.globosum）中獲得了與枯草桿菌蛋白酶相似的絲氨酸蛋白酶基因（ser）的DNA和cDNA序列。全長cDNA克隆的5’-和3’-端序列，已經從全菌的EST文庫中采取分子生物學和生物信息學的方法獲得。在這兩個EST的基礎

3、上，球毛殼菌的類枯草桿菌絲氨酸蛋白酶已經通過PCR方法擴增出來，cDNA和mRNA的全序列已經呈遞給NCBI，并得到序列號分別為FJ589720and FJ589721。結合生物信息學和分子生物學方法，從球毛殼菌（C.globosum）的cDNA文庫中成功克隆出絲氨酸蛋白酶基因（ser）的cDNA序列。cDNA的全長為1608-bp，編碼535個氨基酸，預測的分子量為57.2 kDa；等電點為5.93。DNA序列長為1682-bp，由2

4、個外顯子和1個內含子組成。兩個外顯子的長度分別為372和1236-bp，內含子的長度為74-bp。外顯子和內含子之間的剪切位點符合GT/AG規(guī)則。SignalP預測分析顯示：絲氨酸蛋白酶基因（ser）為分泌蛋白，在 N端有一個由16個氨基酸殘基組成的信號肽序列，信號肽的切割位點位于第15位和第16位的丙氨酸（Ala）之間。從此基因推導出的氨基酸序列與其它真菌來源的絲氨酸蛋白酶有超過80％的同源性，初步斷定它屬于S8超家族。
　　在

5、細菌啟動子P7的作用下，用用大腸桿菌表達質粒pET-52b(+)構建了重組質粒pET-52b/Ser，轉化大腸桿菌E.coli TOP10中，并將抽提出的經過復制的重組質粒轉入大腸桿菌E.coliBL21后進行蛋白酶的表達研究。這兩次轉化過程，均經過菌落PCR和限制性內切酶雙酶切檢驗。SDS-PAGE結果顯示，目的基因表達不明顯；酶活性檢測為在誘導5h后絲氨酸蛋白酶活性最高為0.171U/10ml。絲氨酸蛋白酶的最適pH為4.5，在pH