小菜蛾中腸絲氨酸蛋白酶基因的克隆、轉錄及其酶活的研究.pdf

1、絲氨酸蛋白酶家族是一個超基因家族，主要包括胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶兩大類，在昆蟲的免疫反應、食物消化及蛻皮變態(tài)的過程中起著重要的作用。昆蟲從外界攝取的大分子營養(yǎng)物質需經腸道內一系列的消化酶分解成小分子物質后才能被蟲體吸收利用，因此，昆蟲對食物的消化和吸收對昆蟲的生長發(fā)育起著重要的作用。
　　 本文克隆了四個小菜蛾絲氨酸蛋白酶基因，并對其功能進行了初步研究?，F(xiàn)將研究結果總結如下:
　　 1)采用cDNA末端快速擴增技術(RA

2、CE)獲得了4條cDNA的全長序列，所克隆的4條全長cDNA序列命名為Pxsp-A、Pxsp-B、Pxsp-C和Pxsp-D，長度分別為914、924、933及1038bp，開放閱讀框長度分別為795、768、816及879bp，分別編碼264、255、271、292個氨基酸，預測分子量分別為28.8kDa、27.6kDa、29.7kDa、30.9kDa。序列分析結果表明，Pxsp-A、Pxsp-B、Pxsp-C及Pxsp-D均含有信號

3、肽序列。多序列比對結果表明，對絲氨酸蛋白酶基因做進化樹分析，4個基因形成了3大組，第一組為Pxsp-A，第二組由Pxsp-B和Pxsp-C組成，第三組為Pxsp-D。
　　 2)明確了絲氨酸蛋白酶基因在小菜蛾不同齡期中的轉錄規(guī)律。分別于小菜蛾2齡中、3齡初、3齡末、4齡初、4齡中、4齡末6個不同發(fā)育期取樣，提取中腸RNA，進行rt-qPCR檢測。結果顯示，在小菜蛾2齡中期至4齡中期，Pxsp-A、Pxsp-B、Pxsp-C及Px

4、sp-D四個基因的表達量逐漸升高，并且在4齡中達到峰值，而后基因的表達量逐漸回落，且Pxsp-B和Pxsp-C的表達量顯著高于Pxsp-A及Pxsp-D。
　　 3)明確了菜蛾盤絨繭蜂寄生對絲氨酸蛋白酶基因的轉錄水平的調控。分別于寄生后0h、24h、48h、72h、96h取寄主小菜蛾幼蟲各30頭，進行取樣，提取中腸RNA。同時，以未寄生小菜蛾為對照，提取小菜蛾中腸RNA，進行rt-qPCR檢測。結果顯示，寄生后Pxsp-A、Px

5、sp-B、Pxsp-C及Pxsp-D的表達量均有所下降，而且寄生對Pxsp-C的影響最大，其次是Pxsp-B和Pxsp-D，寄生對Pxsp-A的影響最小。
　　 4)探究了菜蛾盤絨繭蜂寄生對寄主小菜蛾中腸絲氨酸蛋白酶酶活的影響。結果顯示，從2齡至4齡末期，未寄生小菜蛾中腸內總絲氨酸蛋白酶的活性略高于寄生后小菜蛾;其次，寄生后中腸內各類消化酶成分發(fā)生顯著變化，中腸中酶平衡被打破;最后，小菜蛾被寄生后其中腸內的總絲氨酸蛋白酶、胰蛋白

6、酶、胰凝乳蛋白酶活性均產生了明顯變化。我們還檢測了蛋白酶抑制劑對小菜蛾中腸酶活性的影響。當分別加入抑制劑4-amidinophenylmethanesulfonyl fluoride hydrochloride(APMSF)和(S)-1-chloro-4-phenyl-3-tosylamido-2-butanone(TPCK)時總蛋白酶的活性受到抑制;當以胰蛋白酶作為底物時，APMSF對胰蛋白酶有顯著抑制作用，而TPCK抑制作用有限;當