Ⅱ型跨膜絲氨酸蛋白酶與惡性血液疾病的研究.pdf

1、目的:Ⅱ型跨膜絲氨酸蛋白酶(TypeⅡ Transmembrane Serine Proteases，TTSPs)是一類(lèi)通過(guò)氨基末端跨膜區(qū)域錨定在細(xì)胞膜上的絲氨酸蛋白酶，在哺乳動(dòng)物的許多生物學(xué)過(guò)程中扮演著重要角色，其功能異?？蓪?dǎo)致癌癥、缺鐵性貧血、耳聾、心血管疾病等。在人類(lèi)，TTSPs共有17個(gè)成員，其中研究比較廣泛的matriptase在正常生理、病理及腫瘤中起著廣泛而重要的作用，但是它在惡性血液疾病如慢性淋巴細(xì)胞白血病(Chroni

2、c Lymphocytic Leukemia，CLL)中的生物學(xué)功能目前尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。本研究旨在探討Ⅱ型跨膜絲氨酸蛋白酶在惡性血液疾病細(xì)胞中的表達(dá)?；谇捌谘芯拷Y(jié)果，我們以matriptase作為重點(diǎn)研究對(duì)象，深入探討matriptase在CLL中的作用及機(jī)制，為進(jìn)一步研究Ⅱ型跨膜絲氨酸蛋白酶的功能以及它們?cè)趷盒匝杭膊“l(fā)生發(fā)展中的作用提供依據(jù)。
　　 方法:
　　 (1)利用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Reverse tra

3、nscription PCR，RT-PCR)技術(shù)對(duì)人惡性血液病細(xì)胞系和惡性血液病患者骨髓細(xì)胞中17種TTSPs mRNA的表達(dá)進(jìn)行分析;
　　 (2)實(shí)時(shí)定量PCR(Quantitative real-time PCR，qRT-PCR)檢測(cè)白血病患者骨髓細(xì)胞中 matriptase及其內(nèi)源性特異性抑制劑肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子激活物抑制劑1(Hepatocyte growth factor activator inhibitor-1,HA

4、I-1)mRNA的表達(dá);
　　 (3) Western blot檢測(cè)惡性血液病細(xì)胞系和白血病患者骨髓細(xì)胞中matriptase蛋白的表達(dá);
　　 (4)流式細(xì)胞術(shù)和免疫熒光染色檢測(cè)Namalwa細(xì)胞系和CLL患者骨髓細(xì)胞中matriptase蛋白的表達(dá)及定位，以正常人外周血(Normal peripheral blood，NPB)白細(xì)胞作對(duì)照;
　　 (5)利用磷酸鈣沉淀法制備慢病毒，并轉(zhuǎn)導(dǎo)B細(xì)胞來(lái)源的淋巴瘤細(xì)胞

5、系Namalwa用于干擾matriptase mRNA的表達(dá)，qRT-PCR和Western blot技術(shù)檢測(cè)干擾效率;
　　 (6)基底膜侵襲實(shí)驗(yàn)(Transwell Invasion Assay)檢測(cè)matriptase表達(dá)下調(diào)后及matriptase特異性抑制劑HAI-1作用后腫瘤細(xì)胞侵襲能力的改變;
　　 (7)細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)(Transwell Migration Assay)檢測(cè)HAI-1作用后腫瘤細(xì)胞遷移能力

6、的改變;
　　 (8)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)(Cell Counting Kit-8，CCK-8)檢測(cè)HAI-1作用后腫瘤細(xì)胞增殖能力的影響。
　　 結(jié)果:
　　 (1)采用RT-PCR技術(shù)對(duì)15種人惡性血液病細(xì)胞系和81例惡性血液病患者骨髓細(xì)胞中17種TTSPs mRNA的表達(dá)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)matriptase、HATL4、polyserase-1等TTSPs mRNA在某些惡性血液病細(xì)胞系或白血病患者骨髓細(xì)胞中特異性高

7、表達(dá)，如matriptase mRNA在B細(xì)胞來(lái)源的淋巴瘤細(xì)胞系(Namalwa和Raji)和CLL患者骨髓細(xì)胞中表達(dá)特異性增高，而在其它惡性血液病細(xì)胞系或白血病骨髓患者細(xì)胞中基本檢測(cè)不到表達(dá);HATL4 mRNA在急性髓系白血病(AcuteMyelocytic Leukemia，AML)患者骨髓細(xì)胞中表達(dá)特異性增高，而在其它白血病患者骨髓細(xì)胞中基本檢測(cè)不到表達(dá)。我們以在慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)中高表達(dá)的matriptase作為重點(diǎn)

8、研究對(duì)象，進(jìn)一步探討其在CLL病程進(jìn)展中的生物學(xué)功能及作用機(jī)制。
　　 (2) qRT-PCR技術(shù)定量地檢測(cè)了49例白血病患者骨髓細(xì)胞中matriptase和HAI-1 mRNA的表達(dá)。結(jié)果顯示matriptase mRNA在CLL患者骨髓細(xì)胞中高水平表達(dá)，表達(dá)量為正常人外周血(Normal Peripheral Blood，NPB)和正常人骨髓(Normal bone Marrow，NBM)細(xì)胞表達(dá)量的22倍以上，在其它類(lèi)型白

9、血病患者如AML、急性淋巴細(xì)胞白血病(Acute Lymphocytic Leukemia，ALL)、慢性粒細(xì)胞性白血?。–hronic Myelocytic Leukemia，CML）中幾乎檢測(cè)不到;而HAI-1 mRNA在CLL中的表達(dá)量很低。
　　 (3)利用Westem blot檢測(cè)人惡性血液病細(xì)胞系和白血病患者骨髓細(xì)胞中matriptase蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示 matriptase在B細(xì)胞來(lái)源的淋巴瘤細(xì)胞系(Namal

10、wa和 Raji)和CLL患者骨髓細(xì)胞中表達(dá)明顯增加，而在其它細(xì)胞系或白血病患者骨髓細(xì)胞中檢測(cè)不到，與mRNA的表達(dá)結(jié)果一致。
　　 (4)流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明matriptase在Namalwa細(xì)胞和CLL患者骨髓細(xì)胞中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為99％和93％，而在NPB細(xì)胞表面的表達(dá)為陰性(0.5％)。免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)，matriptase定位于Namalwa和CLL患者骨髓細(xì)胞的膜表面，且表達(dá)量明顯高于NPB。
　　 (5)

11、將含siM（包含特異性沉默matriptase的shRNA核苷酸序列）和siC（包含一段無(wú)義的對(duì)照shRNA核苷酸序列）穿梭質(zhì)粒的病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)Namalwa細(xì)胞，siM和siC病毒載體上含有綠色熒光蛋白(Green Fluorescent Protein，GFP)。培養(yǎng)72h后，流式分選得到GFP陽(yáng)性率大于99％的細(xì)胞。通過(guò)qRT-PCR和Western blot技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組siC相比，在轉(zhuǎn)導(dǎo)siM病毒的Namalwa細(xì)胞中，ma

12、triptasemRNA和蛋白表達(dá)抑制率＞80％。這一結(jié)果表明，我們采用shRNA沉默matriptase表達(dá)的實(shí)驗(yàn)是成功的，可用于后續(xù)相關(guān)的功能學(xué)研究。
　　 (6)基底膜侵襲實(shí)驗(yàn)表明，Namalwa細(xì)胞的matriptase mRNA表達(dá)下調(diào)后，穿過(guò)基底膜Matrigel膠的細(xì)胞數(shù)量明顯減少;通過(guò)HAI-1抑制 matriptase蛋白活性后，Namalwa和Raji細(xì)胞降解基底膜Matrigel膠的能力均顯著降低;HAI-

13、1作用于CLL患者骨髓細(xì)胞后，與加入緩沖液對(duì)照(Buffer Ctrl)組相比，CLL細(xì)胞降解基底膜Matrigel膠的能力顯著降低，而加入胰蛋白酶抑制劑(Soybean TrypsinInhibitor，STI)組則沒(méi)有差異。這提示matriptase可能通過(guò)降解細(xì)胞外基底膜來(lái)增強(qiáng)細(xì)胞的侵襲性，參與CLL的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，這一作用能被HAI-1所抑制。
　　 (7)腫瘤細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)表明，加入不同濃度HAI-1后，Namalwa、

14、Raji以及CLL患者骨髓細(xì)胞的遷移能力沒(méi)有明顯改變。
　　 (8)腫瘤細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)表明，加入不同濃度HAI-1后，Namalwa、Raji以及CLL患者骨髓細(xì)胞的增殖能力沒(méi)有明顯改變。
　　 結(jié)論:我們?cè)趪?guó)內(nèi)外最先研究發(fā)現(xiàn)matriptase在CLL患者骨髓細(xì)胞中特異性高表達(dá)，提示matriptase可能成為CLL新的細(xì)胞膜生物標(biāo)記。下調(diào)白血病細(xì)胞中matriptase的表達(dá)及用其特異性抑制劑HAI-1抑制matrip