絲氨酸蛋白酶testisin與腎陽虛生殖功能下降的研究.pdf

1、研究背景:
　　祖國醫(yī)學(xué)認(rèn)為，不孕癥常與腎陽虛密切有關(guān)。testisin是一種糖基磷脂酰肌醇錨定的絲氨酸蛋白酶，首次發(fā)現(xiàn)在睪丸和附睪精子表面并在精子生成、附睪精子成熟和受精中起重要作用。盡管最近有研究顯示，testisin可能參與精子在女性生殖道的獲能、頂體反應(yīng)以及受精等過程，但并沒有研究報道testisin在女性生殖系統(tǒng)的作用。因此，我們假設(shè)testisin可能具有影響女性生殖系統(tǒng)的作用，并作為女性腎陽虛生殖功能下降的評價指標(biāo)之

2、一。為了驗證我們的假設(shè)，我們首先建立腎陽虛生殖功能下降的動物模型，比較其子宮、卵巢、輸卵管以及外周血testisin基因與正常動物的表達(dá)差異。其次，我們進(jìn)一步比較了腎陽虛生殖功能下降的模型動物與使用溫腎壯陽中藥葫蘆巴的模型動物testisin基因的表達(dá)，如果該基因表達(dá)有改善，則證明了該基因與腎陽虛生殖功能下降的關(guān)聯(lián)。最后，我們檢測了陽虛不孕患者testisin基因的表達(dá)，探討testisin基因是否具有臨床應(yīng)用價值。
　　一羥基脲

3、建立腎陽虛小鼠模型及與testisin基因表達(dá)的研究
　　目的:
　　建立腎陽虛小鼠模型，觀察其生殖系統(tǒng)是否有testisin基因表達(dá)以及與腎陽虛及生殖功能的關(guān)系。
　　材料與方法:
　　將49只雌性昆明小鼠隨機(jī)分為造模組和對照組，造模組灌胃羥基脲造模，對照組灌胃生理鹽水，連續(xù)灌胃9天。在造模期間，每日稱重及陰道涂片，并隔日監(jiān)測小鼠肛溫。第10天將各組小鼠麻醉后行紅外熱成像（TTM）掃描子宮溫度。此后，處死動物前

4、收集其外周血樣品，處死小鼠后收集其卵巢、子宮以及輸卵管，稱量卵巢濕重；一側(cè)子宮、卵巢用于HE染色形態(tài)學(xué)觀察，另一側(cè)則進(jìn)行組織裂解進(jìn)行qRT-PCR分析，以檢測testisin mRNA表達(dá)。同時，外周血細(xì)胞也用于qRT-PCR分析，檢測testisin mRNA表達(dá)。最后，將剩余小鼠與雄性小鼠合籠，以觀察受孕率。
　　結(jié)果:
　　羥基脲造模后，造模組小鼠表現(xiàn)出較典型的陽虛癥狀：為弓背蜷縮、豎毛而無光澤、擠臥、倦怠懶動、行動遲

5、緩、瞇眼嗜睡、肢尾涼、耳尾蒼白、飲食及飲水量明顯減少、大便溏；敲打籠盞時緩慢挪動或無明顯反應(yīng)、抓取時掙扎無力、易抓取；體重、肛溫明顯下降。此外，模型小鼠陰道分泌物表現(xiàn)出量增多、色透明且質(zhì)清稀的特征，這是生殖系統(tǒng)典型的陽虛證表現(xiàn)之一。TTM掃描顯示造模組小鼠子宮溫度與對照組比較顯著降低（P＜0.05），而造模組小鼠卵巢濕重/指數(shù)、卵泡數(shù)、子宮內(nèi)膜厚度等均明顯低于對照組（P＜0.05）；HE染色可見卵巢原始卵泡、初級卵泡、次級卵泡，但竇狀卵

6、泡、排卵前卵泡均較少，黃體形成較少或無。與雄鼠交配結(jié)果顯示造模組小鼠受孕率為0％。與對照組比較，模型小鼠外周血細(xì)胞testisin mRNA表達(dá)顯著減少（P＜0.05），而子宮testisin mRNA表達(dá)顯著升高（P＜0.05）。但造模組卵巢和輸卵管testisin mRNA表達(dá)與對照組比較無顯著變化（P＞0.05）。
　　結(jié)論:
　　在本次實驗中，我們提供了子宮、卵巢、輸卵管以及外周血細(xì)胞中存在testisin基因表達(dá)的

7、證據(jù)。與對照組比較，在腎陽虛模型小鼠子宮中testisin基因表達(dá)增加，而在外周血細(xì)胞中減少。這表明testisin基因可能與女性腎陽虛生殖功能下降相關(guān)聯(lián)。
　　二葫蘆巴對羥基脲腎陽虛小鼠模型testisin基因表達(dá)及生殖功能的影響
　　目的:
　　進(jìn)一步證實testisin基因的表達(dá)水平是否與腎陽虛生殖功能下降有關(guān)。
　　材料與方法:
　　將73只昆明雌性小鼠隨機(jī)分為對照組（N=24）、造模組（N=25）

8、、葫蘆巴組（N=24），對照組灌胃生理鹽水，造模組和葫蘆巴組首先以羥基脲灌胃，持續(xù)9天。第10天，葫蘆巴組以葫蘆巴湯劑代替灌胃，持續(xù)7天。小鼠陽虛癥狀觀察、樣品收集和實驗室檢測均與第一部分實驗所描述相同。
　　結(jié)果:
　　與造模組小鼠比較，葫蘆巴組小鼠陽虛癥狀明顯改善。TTM掃描顯示葫蘆巴組小鼠子宮溫度明顯升高（P＜0.05）；葫蘆巴組小鼠卵巢濕重/指數(shù)、卵泡數(shù)、子宮內(nèi)膜厚度等指標(biāo)也均得以改善；葫蘆巴組小鼠卵巢可觀察到各級卵

9、泡生長，其形態(tài)正常且有多個黃體形成；與造模組小鼠比較，葫蘆巴組小鼠受孕率也顯著提高至60%。qRT-PCR結(jié)果顯示，葫蘆巴組小鼠外周血細(xì)胞testisin基因表達(dá)較造模組小鼠顯著上調(diào)（P＜0.05），而減少了子宮testisin基因的表達(dá)上調(diào)（P＜0.05）。
　　結(jié)論:
　　葫蘆巴可明顯改善腎陽虛模型小鼠陽虛癥狀，而且其testisin基因表達(dá)水平也向正常動物的表達(dá)水平恢復(fù)，這進(jìn)一步驗證了testisin與腎陽虛生殖功能下

10、降的關(guān)聯(lián)。
　　三陽虛不孕患者外周血細(xì)胞testisin基因表達(dá)研究
　　目的:
　　檢測臨床陽虛不孕患者testisin基因表達(dá)，探討testisin基因是否具有潛在的臨床應(yīng)用價值。
　　材料與方法:
　　將22例陽虛體質(zhì)不孕患者作為研究對象，而6例正常健康人作為對照。收集外周血樣品，采用qRT-PCR檢測血細(xì)胞testisin基因的表達(dá)，實驗室檢測方法與第二部分實驗所描述相同。
　　結(jié)果:

11、　　與對照組相比較，陽虛組外周血細(xì)胞testisin基因表達(dá)呈顯著下調(diào)（P＜0.05）。
　　結(jié)論:
　　臨床患者陽虛不孕證與腎陽虛伴生殖功能下降動物模型癥狀相似，其外周血細(xì)胞testisin基因表達(dá)的結(jié)果與實驗動物模型結(jié)果一致，這表明該基因表達(dá)分析可用以診斷陽虛不孕證，并在臨床治療過程中具有潛在的臨床應(yīng)用價值。
　　總結(jié):
　　通過以上實驗研究表明:1）testisin基因在雌性小鼠生殖系統(tǒng)有表達(dá)；2）test