絲氨酸蛋白酶testisin與腎陽虛生殖功能下降的研究.pdf

1、研究背景:
　　祖國(guó)醫(yī)學(xué)認(rèn)為，不孕癥常與腎陽虛密切有關(guān)。testisin是一種糖基磷脂酰肌醇錨定的絲氨酸蛋白酶，首次發(fā)現(xiàn)在睪丸和附睪精子表面并在精子生成、附睪精子成熟和受精中起重要作用。盡管最近有研究顯示，testisin可能參與精子在女性生殖道的獲能、頂體反應(yīng)以及受精等過程，但并沒有研究報(bào)道testisin在女性生殖系統(tǒng)的作用。因此，我們假設(shè)testisin可能具有影響女性生殖系統(tǒng)的作用，并作為女性腎陽虛生殖功能下降的評(píng)價(jià)指標(biāo)之

2、一。為了驗(yàn)證我們的假設(shè)，我們首先建立腎陽虛生殖功能下降的動(dòng)物模型，比較其子宮、卵巢、輸卵管以及外周血testisin基因與正常動(dòng)物的表達(dá)差異。其次，我們進(jìn)一步比較了腎陽虛生殖功能下降的模型動(dòng)物與使用溫腎壯陽中藥葫蘆巴的模型動(dòng)物testisin基因的表達(dá)，如果該基因表達(dá)有改善，則證明了該基因與腎陽虛生殖功能下降的關(guān)聯(lián)。最后，我們檢測(cè)了陽虛不孕患者testisin基因的表達(dá)，探討testisin基因是否具有臨床應(yīng)用價(jià)值。
　　一羥基脲

3、建立腎陽虛小鼠模型及與testisin基因表達(dá)的研究
　　目的:
　　建立腎陽虛小鼠模型，觀察其生殖系統(tǒng)是否有testisin基因表達(dá)以及與腎陽虛及生殖功能的關(guān)系。
　　材料與方法:
　　將49只雌性昆明小鼠隨機(jī)分為造模組和對(duì)照組，造模組灌胃羥基脲造模，對(duì)照組灌胃生理鹽水，連續(xù)灌胃9天。在造模期間，每日稱重及陰道涂片，并隔日監(jiān)測(cè)小鼠肛溫。第10天將各組小鼠麻醉后行紅外熱成像（TTM）掃描子宮溫度。此后，處死動(dòng)物前

4、收集其外周血樣品，處死小鼠后收集其卵巢、子宮以及輸卵管，稱量卵巢濕重；一側(cè)子宮、卵巢用于HE染色形態(tài)學(xué)觀察，另一側(cè)則進(jìn)行組織裂解進(jìn)行qRT-PCR分析，以檢測(cè)testisin mRNA表達(dá)。同時(shí)，外周血細(xì)胞也用于qRT-PCR分析，檢測(cè)testisin mRNA表達(dá)。最后，將剩余小鼠與雄性小鼠合籠，以觀察受孕率。
　　結(jié)果:
　　羥基脲造模后，造模組小鼠表現(xiàn)出較典型的陽虛癥狀：為弓背蜷縮、豎毛而無光澤、擠臥、倦怠懶動(dòng)、行動(dòng)遲

5、緩、瞇眼嗜睡、肢尾涼、耳尾蒼白、飲食及飲水量明顯減少、大便溏；敲打籠盞時(shí)緩慢挪動(dòng)或無明顯反應(yīng)、抓取時(shí)掙扎無力、易抓??；體重、肛溫明顯下降。此外，模型小鼠陰道分泌物表現(xiàn)出量增多、色透明且質(zhì)清稀的特征，這是生殖系統(tǒng)典型的陽虛證表現(xiàn)之一。TTM掃描顯示造模組小鼠子宮溫度與對(duì)照組比較顯著降低（P＜0.05），而造模組小鼠卵巢濕重/指數(shù)、卵泡數(shù)、子宮內(nèi)膜厚度等均明顯低于對(duì)照組（P＜0.05）；HE染色可見卵巢原始卵泡、初級(jí)卵泡、次級(jí)卵泡，但竇狀卵

6、泡、排卵前卵泡均較少，黃體形成較少或無。與雄鼠交配結(jié)果顯示造模組小鼠受孕率為0％。與對(duì)照組比較，模型小鼠外周血細(xì)胞testisin mRNA表達(dá)顯著減少（P＜0.05），而子宮testisin mRNA表達(dá)顯著升高（P＜0.05）。但造模組卵巢和輸卵管testisin mRNA表達(dá)與對(duì)照組比較無顯著變化（P＞0.05）。
　　結(jié)論:
　　在本次實(shí)驗(yàn)中，我們提供了子宮、卵巢、輸卵管以及外周血細(xì)胞中存在testisin基因表達(dá)的

7、證據(jù)。與對(duì)照組比較，在腎陽虛模型小鼠子宮中testisin基因表達(dá)增加，而在外周血細(xì)胞中減少。這表明testisin基因可能與女性腎陽虛生殖功能下降相關(guān)聯(lián)。
　　二葫蘆巴對(duì)羥基脲腎陽虛小鼠模型testisin基因表達(dá)及生殖功能的影響
　　目的:
　　進(jìn)一步證實(shí)testisin基因的表達(dá)水平是否與腎陽虛生殖功能下降有關(guān)。
　　材料與方法:
　　將73只昆明雌性小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（N=24）、造模組（N=25）

8、、葫蘆巴組（N=24），對(duì)照組灌胃生理鹽水，造模組和葫蘆巴組首先以羥基脲灌胃，持續(xù)9天。第10天，葫蘆巴組以葫蘆巴湯劑代替灌胃，持續(xù)7天。小鼠陽虛癥狀觀察、樣品收集和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)均與第一部分實(shí)驗(yàn)所描述相同。
　　結(jié)果:
　　與造模組小鼠比較，葫蘆巴組小鼠陽虛癥狀明顯改善。TTM掃描顯示葫蘆巴組小鼠子宮溫度明顯升高（P＜0.05）；葫蘆巴組小鼠卵巢濕重/指數(shù)、卵泡數(shù)、子宮內(nèi)膜厚度等指標(biāo)也均得以改善；葫蘆巴組小鼠卵巢可觀察到各級(jí)卵

9、泡生長(zhǎng)，其形態(tài)正常且有多個(gè)黃體形成；與造模組小鼠比較，葫蘆巴組小鼠受孕率也顯著提高至60%。qRT-PCR結(jié)果顯示，葫蘆巴組小鼠外周血細(xì)胞testisin基因表達(dá)較造模組小鼠顯著上調(diào)（P＜0.05），而減少了子宮testisin基因的表達(dá)上調(diào)（P＜0.05）。
　　結(jié)論:
　　葫蘆巴可明顯改善腎陽虛模型小鼠陽虛癥狀，而且其testisin基因表達(dá)水平也向正常動(dòng)物的表達(dá)水平恢復(fù)，這進(jìn)一步驗(yàn)證了testisin與腎陽虛生殖功能下

10、降的關(guān)聯(lián)。
　　三陽虛不孕患者外周血細(xì)胞testisin基因表達(dá)研究
　　目的:
　　檢測(cè)臨床陽虛不孕患者testisin基因表達(dá)，探討testisin基因是否具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。
　　材料與方法:
　　將22例陽虛體質(zhì)不孕患者作為研究對(duì)象，而6例正常健康人作為對(duì)照。收集外周血樣品，采用qRT-PCR檢測(cè)血細(xì)胞testisin基因的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法與第二部分實(shí)驗(yàn)所描述相同。
　　結(jié)果:

11、　　與對(duì)照組相比較，陽虛組外周血細(xì)胞testisin基因表達(dá)呈顯著下調(diào)（P＜0.05）。
　　結(jié)論:
　　臨床患者陽虛不孕證與腎陽虛伴生殖功能下降動(dòng)物模型癥狀相似，其外周血細(xì)胞testisin基因表達(dá)的結(jié)果與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型結(jié)果一致，這表明該基因表達(dá)分析可用以診斷陽虛不孕證，并在臨床治療過程中具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。
　　總結(jié):
　　通過以上實(shí)驗(yàn)研究表明:1）testisin基因在雌性小鼠生殖系統(tǒng)有表達(dá)；2）test