家蠶絲氨酸蛋白酶BmSP125在表皮發(fā)育過程中的功能研究.pdf

1、絲氨酸蛋白酶(SP)是一個(gè)大的蛋白酶家族，占整個(gè)蛋白水解酶類的1/3，主要參與蛋白質(zhì)的降解和合成，是生物體維持正常生命活動(dòng)不可缺少的酶類，通過絲氨酸蛋白酶抑制劑調(diào)節(jié)其活性，從而維持昆蟲體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。絲氨酸蛋白酶依賴于活性中心Ser、His和Asp形成的催化三聯(lián)體來水解蛋白質(zhì)。根據(jù)活性位點(diǎn)的完整性，絲氨酸蛋白酶分為活性位點(diǎn)完整的絲氨酸蛋白酶和活性位點(diǎn)不完整的絲氨酸蛋白酶同源物。絲氨酸蛋白酶種類豐富，根據(jù)靶標(biāo)基團(tuán)的不同，可將其分為胰蛋白酶

2、、胰凝乳蛋白酶、彈性蛋白酶等主要類型。絲氨酸蛋白酶一般以酶原的形式合成，隨著N端被水解切割而激活。在哺乳動(dòng)物中，絲氨酸蛋白酶在消化、凝血和補(bǔ)體反應(yīng)等生理過程中扮演著很重要的角色，而且在昆蟲中，絲氨酸蛋白酶不僅參與昆蟲的消化代謝，在昆蟲的免疫防御和生長發(fā)育等過程中也起著重要的作用。在昆蟲的免疫系統(tǒng)中和胚胎發(fā)育中，含clip結(jié)構(gòu)域的絲氨酸蛋白酶主要參與外源信號的調(diào)制和擴(kuò)大。同時(shí)在昆蟲特有的絲氨酸蛋白酶激活系統(tǒng)中，根據(jù)clip絲氨酸蛋白酶在激

3、活路徑中的位置，可分為終端酶和次終端酶。
　　 本實(shí)驗(yàn)室在先前的研究中已鑒定出18個(gè)家蠶clip絲氨酸蛋白酶，本研究在此基礎(chǔ)上，選取其中的clip絲氨酸蛋白酶BmSP125基因作為研究對象，對其進(jìn)行序列分析和表達(dá)特征分析;利用原核表達(dá)獲得重組蛋白制備了BmSP125多克隆抗體，然后用BmSP125多克隆抗體檢測其在家蠶體內(nèi)的合成;最后利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)獲得有生物學(xué)活性的重組蛋白質(zhì)，分析探索BmSP125在表皮發(fā)育過程中的功能。

4、主要研究結(jié)果如下:
　　 1.家蠶絲氨酸蛋白酶BmSP125的序列分析和表達(dá)特征分析
　　 基于NCBI和家蠶基因組數(shù)據(jù)庫silkDB，輔以在線軟件，我們對BmSP125基因進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)該基因全長1173bp，包括4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子，編碼390個(gè)氨基酸，其中1-19位氨基酸為信號肽序列，預(yù)測切除信號肽后的蛋白質(zhì)的分子量為40.5kDa，等電點(diǎn)為6.5，激活位點(diǎn)為精氨酸(R)。序列同源性分析結(jié)果表明，家蠶

5、(Bombyxmori)BmSP125與美國白蛾(Hyphantriacunea)凝血蛋白HcCLP2，煙草天蛾(Manducasexta)血淋巴蛋白MsHP17氨基酸序列相似度分別為71％和68％，推測它們可能具有相似的功能。
　　 借助于家蠶組織芯片數(shù)據(jù)庫，我們對BmSP125基因在5齡第3家蠶各組織中的表達(dá)情況進(jìn)行了調(diào)查，發(fā)現(xiàn)該基因在5齡第3天的頭中表達(dá)量最高，體壁次之，而在其他組織中表達(dá)量很低或基本上不表達(dá)。另外，從蟻蠶

6、到化蛾的時(shí)期表達(dá)譜發(fā)現(xiàn)，BmSP125基因在幼蟲蛻皮后第一天表達(dá)量最高，在眠期表達(dá)量最低，在蛹期表達(dá)量逐漸升高。
　　 2.家蠶絲氨酸蛋白酶BmSP125基因的原核表達(dá)和抗體制備
　　 基于家蠶基因組精細(xì)圖序列數(shù)據(jù)和BmSP12的預(yù)測基因序列，我們設(shè)計(jì)了BmSP125基因特異引物進(jìn)行克隆和原核表達(dá)。構(gòu)建表達(dá)載體p28-BmSP125，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌細(xì)胞，在不同的條件下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，獲得包涵體形式的重組蛋白，并對重組蛋白進(jìn)

7、行純化，制備了其多克隆抗體。Westernblot結(jié)果顯示抗體與抗原能特異性結(jié)合。
　　 3.家蠶絲氨酸蛋白酶BmSP125的蛋白合成模式和組織定位
　　 利用BmSP125的多克隆抗體，取家蠶4齡第1天、將眠、眠24h和化蛹第1天至化蛹第9天的表皮進(jìn)行Westernblot分析，發(fā)現(xiàn)BmSP125在表皮中有三種形式，分別為復(fù)合體、前體和成熟體。取4齡眠和5齡起的家蠶體壁進(jìn)行BmSP125的免疫熒光定位，結(jié)果顯示BmSP

8、125定位在新皮和舊皮中，進(jìn)一步表明BmSP125與家蠶表皮的發(fā)育有關(guān)。
　　 4.家蠶絲氨酸蛋白酶BmSP125的活性分析和功能初探
　　 利用畢赤酵母真核表達(dá)系統(tǒng)來表達(dá)BmSP125的成熟體，在甲醇誘導(dǎo)24h、48h、96h后的酵母培養(yǎng)基中均有重組蛋白表達(dá)。利用硫酸銨沉淀和陰離子交換柱過濾層析對重組蛋白進(jìn)行純化。BmSP125成熟體重組蛋白能使蛋白水解酶廣譜底物酪蛋白水解，表明BmSP125具有蛋白水解酶活性。BmS