旋毛蟲絲氨酸蛋白酶抑制劑在蟲體侵染腸道上皮細(xì)胞過(guò)程中作用的研究.pdf

1、旋毛蟲病是由旋毛蟲引起的嚴(yán)重威脅公共衛(wèi)生安全的一種疾病，是我國(guó)三大食源性人畜共患寄生蟲病之一，感染者通過(guò)食入感染性幼蟲而感染。旋毛蟲感染性幼蟲穿過(guò)宿主腸道上皮細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)和淋巴循環(huán)是整個(gè)侵染過(guò)程的第一步，有實(shí)驗(yàn)證明旋毛蟲能夠通過(guò)分泌排泄分泌抗原來(lái)調(diào)節(jié)宿主免疫反應(yīng)從而增加蟲體在宿主體內(nèi)的存活率。旋毛蟲絲氨酸蛋白酶抑制劑(SPI)是旋毛蟲排泄分泌抗原中的一種，而SPI超家族成員在結(jié)構(gòu)上相對(duì)保守，廣泛存在于多種生物體內(nèi)，在生物體內(nèi)參與如凝

2、血、炎癥反應(yīng)、補(bǔ)體激活等生理反應(yīng)，在寄生蟲生活史中能夠中和宿主消化酶的消化作用。
　　本試驗(yàn)首先根據(jù)Genebank上提供的絲氨酸蛋白酶抑制劑基因序列(基因登錄號(hào)AF231948.1)設(shè)計(jì)出引物，然后提取了感染45天旋毛蟲肌幼蟲的總RNA，通過(guò)RT-PCR的方法反轉(zhuǎn)錄成cDNA之后通過(guò)引物將該段序列擴(kuò)增出來(lái)，之后連接到PMD-18T載體上進(jìn)行雙酶切、PCR及測(cè)序鑒定，將鑒定正確的樣本進(jìn)行酶切，將目的基因連接到表達(dá)載體pET-28a

3、上，轉(zhuǎn)入表達(dá)感受態(tài)BL-21(DE3)中，在酶切、PCR及測(cè)序鑒定正確的情況下將表達(dá)菌用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，對(duì)誘導(dǎo)條件進(jìn)行優(yōu)化同時(shí)鑒定蛋白的表達(dá)形式，誘導(dǎo)結(jié)果顯示TS11-1蛋白為包涵體表達(dá)，并且在37℃、1 mMIPTG條件下誘導(dǎo)5h能達(dá)到最大表達(dá)量。
　　將TS11-1重組蛋白通過(guò)鎳柱進(jìn)行純化，之后用抗his標(biāo)簽抗體作為一抗用Western-blot的方法對(duì)蛋白進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示該重組蛋白能夠成功表達(dá)。用弗氏佐劑將重組蛋白乳

4、化之后分四次免疫BALB/c小鼠獲得血清，用獲得的多克隆抗體以及抗旋毛蟲血清作為一抗用Western-blot的方法對(duì)該蛋白的免疫原性進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示該重組蛋白能夠被免疫血清識(shí)別并且條帶單一，說(shuō)明TS11-1重組蛋白具有良好的免疫原性和反應(yīng)原性。用間接ELISA檢測(cè)出該多克隆抗體效價(jià)為1∶1×105，說(shuō)明該蛋白能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較高的免疫應(yīng)答。用發(fā)色底物法檢測(cè)TS11-1重組蛋白絲氨酸蛋白酶胰蛋白酶、α-糜蛋白酶和胃蛋白酶的抑制活性的結(jié)

5、果顯示，該重組蛋白對(duì)以上三個(gè)酶的抑制活性分別是71.1％、73％和72.5％。說(shuō)明該蛋白酶具有良好的抑制活性。
　　本實(shí)驗(yàn)還建立起了感染性幼蟲-宿主腸道上皮細(xì)胞體外侵染模型并對(duì)該模型進(jìn)行了條件優(yōu)化。同時(shí)將純化好的TS11-1重組蛋白及其多克隆血清以不同濃度稀釋后分別和模型中的腸道上皮細(xì)胞共培養(yǎng)，然后用感染性幼蟲進(jìn)行侵染實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，加入TS11-1實(shí)驗(yàn)組其侵染率與加入蛋白濃度呈正相關(guān)且200μg/ml的重組蛋白濃度（及200μg

6、/ml以上濃度）使實(shí)驗(yàn)組的侵染率達(dá)到最高水平約為88％（高于對(duì)照組的侵染率）。而TS11-1多克隆血清組的侵染率和血清濃度負(fù)相關(guān)且10％（及其以上）的血清濃度使實(shí)驗(yàn)組的侵染率達(dá)到最低水平，為73.5％，低于對(duì)照組的侵染率。說(shuō)明該蛋白在蟲體侵染腸道上皮細(xì)胞過(guò)程中可能起著一定的作用。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)用實(shí)驗(yàn)室之前表達(dá)成功的旋毛蟲絲氨酸蛋白酶抑制劑TS03044重組蛋白及其多抗血清用以上方法檢測(cè)其對(duì)侵染的影響，結(jié)果顯示無(wú)論Tsp03044重組蛋白或者