旋毛蟲絲氨酸蛋白酶抑制劑在蟲體侵染腸道上皮細胞過程中作用的研究.pdf

1、旋毛蟲病是由旋毛蟲引起的嚴重威脅公共衛(wèi)生安全的一種疾病，是我國三大食源性人畜共患寄生蟲病之一，感染者通過食入感染性幼蟲而感染。旋毛蟲感染性幼蟲穿過宿主腸道上皮細胞進入血液循環(huán)和淋巴循環(huán)是整個侵染過程的第一步，有實驗證明旋毛蟲能夠通過分泌排泄分泌抗原來調(diào)節(jié)宿主免疫反應從而增加蟲體在宿主體內(nèi)的存活率。旋毛蟲絲氨酸蛋白酶抑制劑(SPI)是旋毛蟲排泄分泌抗原中的一種，而SPI超家族成員在結(jié)構(gòu)上相對保守，廣泛存在于多種生物體內(nèi)，在生物體內(nèi)參與如凝

2、血、炎癥反應、補體激活等生理反應，在寄生蟲生活史中能夠中和宿主消化酶的消化作用。
　　本試驗首先根據(jù)Genebank上提供的絲氨酸蛋白酶抑制劑基因序列(基因登錄號AF231948.1)設(shè)計出引物，然后提取了感染45天旋毛蟲肌幼蟲的總RNA，通過RT-PCR的方法反轉(zhuǎn)錄成cDNA之后通過引物將該段序列擴增出來，之后連接到PMD-18T載體上進行雙酶切、PCR及測序鑒定，將鑒定正確的樣本進行酶切，將目的基因連接到表達載體pET-28a

3、上，轉(zhuǎn)入表達感受態(tài)BL-21(DE3)中，在酶切、PCR及測序鑒定正確的情況下將表達菌用IPTG進行誘導表達，對誘導條件進行優(yōu)化同時鑒定蛋白的表達形式，誘導結(jié)果顯示TS11-1蛋白為包涵體表達，并且在37℃、1 mMIPTG條件下誘導5h能達到最大表達量。
　　將TS11-1重組蛋白通過鎳柱進行純化，之后用抗his標簽抗體作為一抗用Western-blot的方法對蛋白進行檢測，結(jié)果顯示該重組蛋白能夠成功表達。用弗氏佐劑將重組蛋白乳

4、化之后分四次免疫BALB/c小鼠獲得血清，用獲得的多克隆抗體以及抗旋毛蟲血清作為一抗用Western-blot的方法對該蛋白的免疫原性進行檢測，結(jié)果顯示該重組蛋白能夠被免疫血清識別并且條帶單一，說明TS11-1重組蛋白具有良好的免疫原性和反應原性。用間接ELISA檢測出該多克隆抗體效價為1∶1×105，說明該蛋白能夠誘導機體產(chǎn)生較高的免疫應答。用發(fā)色底物法檢測TS11-1重組蛋白絲氨酸蛋白酶胰蛋白酶、α-糜蛋白酶和胃蛋白酶的抑制活性的結(jié)

5、果顯示，該重組蛋白對以上三個酶的抑制活性分別是71.1％、73％和72.5％。說明該蛋白酶具有良好的抑制活性。
　　本實驗還建立起了感染性幼蟲-宿主腸道上皮細胞體外侵染模型并對該模型進行了條件優(yōu)化。同時將純化好的TS11-1重組蛋白及其多克隆血清以不同濃度稀釋后分別和模型中的腸道上皮細胞共培養(yǎng)，然后用感染性幼蟲進行侵染實驗，結(jié)果表明，加入TS11-1實驗組其侵染率與加入蛋白濃度呈正相關(guān)且200μg/ml的重組蛋白濃度（及200μg

6、/ml以上濃度）使實驗組的侵染率達到最高水平約為88％（高于對照組的侵染率）。而TS11-1多克隆血清組的侵染率和血清濃度負相關(guān)且10％（及其以上）的血清濃度使實驗組的侵染率達到最低水平，為73.5％，低于對照組的侵染率。說明該蛋白在蟲體侵染腸道上皮細胞過程中可能起著一定的作用。同時本實驗用實驗室之前表達成功的旋毛蟲絲氨酸蛋白酶抑制劑TS03044重組蛋白及其多抗血清用以上方法檢測其對侵染的影響，結(jié)果顯示無論Tsp03044重組蛋白或者