中國明對蝦絲氨酸蛋白酶、活性氧的產(chǎn)生與消除及其半胱氨酸蛋白酶研究.pdf

1、中國明對蝦是重要的經(jīng)濟(jì)水產(chǎn)養(yǎng)殖物種,主要分布于黃海和渤海。最近對蝦的養(yǎng)殖受到各種微生物的干擾,包括白斑綜合癥病毒,黃頭病毒和陶拉病毒在內(nèi)的比較嚴(yán)重的對蝦病毒。和許多無脊椎動物一‘樣,中國明對蝦沒有獲得性免疫系統(tǒng),只有先天免疫系統(tǒng)。先天免疫包括細(xì)胞免疫和體液免疫。細(xì)胞免疫主要有包被,吞噬和結(jié)節(jié)的形成。體液免疫則包括血液凝集,抗菌肽的合成和酚氧化酶原的活化。酚氧化酶原的活化可以導(dǎo)致黑色素的生成。在黑色素生成的同時,還會產(chǎn)生副產(chǎn)物活性氧自由基

2、。吞噬作用,作為一種細(xì)胞免疫,主要由血細(xì)胞完成,在抵御外界微生物中起到重要的作用。血細(xì)胞可以產(chǎn)生活性氧自由基,例如超氧陰離子,羥自由基和過氧化氫,這些活性分子在感染的組織中含量很高,具有殺滅細(xì)菌的作用。因為高水平的活性氧對宿主的細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用,有機(jī)體在長期的進(jìn)化中,發(fā)展出了不同的策略,以減少活性氧自由基對機(jī)體的負(fù)面影響。在本論文中,我們主要關(guān)注的是對蝦的絲氨酸蛋白酶,和酚氧化酶原的活化有關(guān)。我們還關(guān)注了對蝦的硫氧還蛋白,谷胱甘肽過氧化

3、物酶和谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶和脂肪酸結(jié)合蛋白,在活性氧自由基的清除中起到重要的作用。另外,我們還研究了兩個半胱氨酸蛋白酶,可能參與了對蝦的先天免疫。
　　 一.中國明對蝦絲氨酸蛋白酶及其同系物對弧菌的感染的免疫應(yīng)答
　　 發(fā)夾結(jié)構(gòu)域的絲氨酸蛋白酶和同系物參與了無脊椎動物的先天免疫,包括血淋巴凝集,抗菌肽合成,細(xì)胞黏附和黑化反應(yīng)。模式識別受體識別病原相關(guān)分子模式,啟動絲氨酸蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)。我們從中國明對蝦中克隆到了一個絲氨酸蛋白酶

4、和一個該蛋白酶的同系物基因。絲氨酸蛋白酶和同系物都含有一個位于N-端的發(fā)夾結(jié)構(gòu)域和羧基端的絲氨酸蛋白酶或者絲氨酸蛋白酶樣結(jié)構(gòu)域。與絲氨酸蛋白酶不同,同系物缺少了一個催化殘基,喪失了催化功能。我們研究了這兩個基因的組織分布,并研究了其在血細(xì)胞,肝胰腺和腸中受到弧菌刺激表達(dá)模式的變化。原位雜交結(jié)果顯示,絲氨酸蛋白酶在鰓和血細(xì)胞中可以檢測到陽性信號,在鰓中的信號主要來自于血細(xì)胞。在正常對蝦中,絲氨酸蛋白酶同系物在蛋白水平上主要分布于鰓和胃中。

5、免疫印跡顯示,在鰓和胃中可以檢測到絲氨酸蛋白酶的兩條帶。絲氨酸蛋白酶在正常對蝦組織中有部分被活化,同系物在正常對蝦中處于非活化狀態(tài),只有在受到弧菌刺激后,才部分被活化。我們的研究結(jié)果表明,中國明對蝦的絲氨酸蛋白酶和其同系物可能在中國明對蝦的先天免疫中起到一定的作用。
　　 二.中國明對蝦硒依賴的谷胱甘肽過氧化物酶和兩個谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶
　　 谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)和谷胱甘肽過氧化物酶(GPxs)是細(xì)胞解毒系統(tǒng)的必要

6、組分,可以防御活性氧自由基(ROSs)對機(jī)體造成的損傷。在中國明對蝦中克隆到了兩個谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶基因,一個命名為FcMuGST,另一個命名為FcThetaGST。在中國明對蝦中,還克隆到了一個硒谷胱甘肽過氧化物酶(Se-GPx)。多重序列比對顯示,來自不同物種的谷胱甘肽過氧化物酶或者谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶,對酶活性必須的氨基酸殘基是保守的。用RX-PCR的方法研究了這三個基因的組織分布,和受到病原刺激的變化。結(jié)果顯示,FcMuGST和FcGPx

7、轉(zhuǎn)錄本在受到弧菌感染后上調(diào),FcThetaGST在轉(zhuǎn)錄水平上受到弧菌刺激后變化不大。在鰓中,GPx活性在受到弧菌刺激6h后上調(diào),從6到12h維持在相對高的水平。在肝胰腺和腸中,總的GST活性受到細(xì)菌刺激后6h上調(diào),從12到24h逐漸恢復(fù)到正常水平。這三個基因在解毒防御中起到重要的作用。FcMuGST主要負(fù)責(zé)清除因細(xì)菌刺激產(chǎn)生的ROS,而FcThetaGST負(fù)責(zé)內(nèi)源有毒物質(zhì)的清除。
　　 三.中國明對蝦硫氧還蛋白在白斑綜合癥病毒感

8、染后的變化
　　 硫氧還蛋白(TRX)參與細(xì)胞的氧還原調(diào)控,維持細(xì)胞蛋白處于還原狀態(tài)。我們從中國明對蝦中鑒定了一個硫氧還蛋白基因,命名為FcTRX。該基因全長含有777 bp核苷酸,包括一個60 bp5’非翻譯區(qū)(UTR),一個318 bp開放閱讀框(ORF),編碼105個氨基酸的蛋白,一個399 bp3’UTR。FcTRX含有一個TRX結(jié)構(gòu)域,在該結(jié)構(gòu)域內(nèi),有一個保守的基序(CGPC)。SMART分析顯示,該蛋白不含有信號肽。

9、FcTRX的分子量和等電點(diǎn)分別為12 kDa和4.62。FcTRX是一個廣泛分布的基因,其mRNA在血細(xì)胞,心,肝胰腺,鰓,胃和腸中可以檢測到,在肝胰腺中表達(dá)水平最高,受到白斑病毒刺激12h后,在肝胰腺中表達(dá)水平降到最低。在鰓中,受白斑病毒刺激后6h,達(dá)到最高水平。免疫印跡結(jié)果顯示,在肝胰腺中,FcTRX蛋白在受到白斑病毒刺激2到12h下調(diào),然后恢復(fù)到正常水平。在鰓中,從6到24 h,該蛋白逐漸升高。中國明對蝦的硫氧還蛋白在抗白斑病毒中

10、起到一定的作用。
　　 四.中國明對蝦脂肪酸結(jié)合蛋白
　　 脂肪酸結(jié)合蛋白(FABP)參與了脂肪酸代謝。FABPs,屬于脂質(zhì)結(jié)合蛋白超家族,在脂肪酸代謝中發(fā)揮重要的作用,同時參與了脊椎動物的先天免疫。從中國明對蝦的肝胰腺中克隆到了脂肪酸結(jié)合蛋白基因,命名為FcFABP,大小715bp,編碼一個14 kDa蛋白。FcFABP是一個堿性脂肪酸結(jié)合蛋白,等電點(diǎn)為9.16。和脊椎動物,無脊椎動物的脂肪酸結(jié)合蛋白都有相似性。進(jìn)化樹

11、分析顯示,中國明對蝦的脂肪酸結(jié)合蛋白和凡納對蝦的脂肪酸結(jié)合蛋白屬于一個分支。FcFABP在肝胰腺中表達(dá),受到白斑病毒刺激上調(diào)表達(dá)。但是,在受到弧菌刺激后卻下調(diào)表達(dá)。重組表達(dá)的蛋白還具有細(xì)菌結(jié)合活性。我們的研究顯示,該脂肪酸代謝相關(guān)的蛋白可能參與了對蝦的先天免疫。
　　 五.中國明對蝦兩個半胱氨酸蛋白酶
　　 組織蛋白酶L(CathL)and legumain/天冬酰胺內(nèi)肽酶(AEP)是兩種半胱氨酸蛋白酶(CPs).在中國

12、明對蝦中克隆到了兩個半胱氨酸蛋白酶基因,命名為,FcCathL和FcLegu。FcCathL蛋白含有一個信號肽,一個Inhibitor129結(jié)構(gòu)域和一個Pept_C1結(jié)構(gòu)域。FcLegu蛋白含有一個信號肽和一個Peptidase_C13結(jié)構(gòu)域。FcCathL和FcLegu mRNA在正常對蝦中,主要表達(dá)于肝胰腺中。FcCathL在胃和腸中受到弧菌刺激24h后也可以檢測到。在白斑病毒刺激后12h對蝦的肝胰腺中,FcCathL受上調(diào)表達(dá)。在

13、受到弧菌刺激的肝胰腺中,與對照沒有統(tǒng)計學(xué)上的差異。FcLegu mRNA在肝胰腺中受弧菌刺激下調(diào)。受到白斑病毒刺激后,FcLegu從2到6h,首先下調(diào),然后從12到24h逐漸恢復(fù)。FcCathL蛋白在血細(xì)胞,肝胰腺,鰓,胃和腸中都可以檢測到。免疫印跡顯示,在某些組織中,可以檢測到三條帶,分別代表組織蛋白酶L的前體形式,單鏈形式和成熟的雙鏈形式。在鰓中,還可以檢測到另一條帶。在胃中,只有在受到白斑病毒刺激24h后,才可以檢測到組織蛋白酶L

14、成熟的雙鏈形式。在腸中,受白斑病毒或者弧菌刺激24h后都可以檢測到雙鏈形式。在血細(xì)胞中,只能檢測到前體的酶,受到弧菌或者病毒刺激后,有所上調(diào)。在腸和鰓中,單鏈形式受弧菌和病毒上調(diào)。在胃中,只有在受到白斑病毒刺激后,單鏈形式上調(diào)。在所有檢測的組織中,FcLegu蛋白都可以檢測到。在肝胰腺中,只能檢測到FcLegu蛋白的前體形式。在其它檢測的組織中,只能檢測到活性形式。在胃和鰓中,該蛋白受到弧菌和病毒刺激后下調(diào)。我們首次報道了中國明對蝦的兩