豬囊尾蚴半胱氨酸蛋白酶TsCL-1基因的表達(dá).pdf

1、囊蟲病是由豬帶絳蟲的幼蟲豬囊尾蚴感染豬或人而引起的人畜共患病，半胱氨酸蛋白酶(C!ysteine protease)廣泛地存在于人類、寄生蟲等多種動(dòng)物體內(nèi)。由于寄生蟲半胱氨酸蛋白酶在宿主寄生蟲相互關(guān)系上起著重要作用，并且可作為寄生蟲病化學(xué)治療和免疫預(yù)防的一個(gè)極好的作用靶點(diǎn)，使人們?cè)絹?lái)越關(guān)注該酶的研究。本實(shí)驗(yàn)對(duì)豬囊尾蚴的半胱氨酸蛋白酶基因進(jìn)行了克隆，表達(dá)，為該酶的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。 從豬囊尾蚴中提取總RNA，用DNAStar軟

2、件設(shè)計(jì)TscL-1蛋白基因特異性引物，通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增出960bp的片斷，擴(kuò)增產(chǎn)物、原核表達(dá)載體pGEX-4T-1以及真核表達(dá)載體pPIC9K分別用EcoRI和Not I進(jìn)行雙酶切，克隆TsCL-1基因至原核表達(dá)載體pGEX-4T-1中，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21，經(jīng)酶切、PCR和測(cè)序鑒定證明，TsCL-1基因正確插入到pGEX-4T-1載體。用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物通過(guò)SDS-PAGE和Western-blotting分析證實(shí)Ts

3、CL-1基因在BL21中以包涵體形式表達(dá)，分子量大小為61Ku左右，能被豬囊尾蚴陽(yáng)性血清所識(shí)別；為了獲得活性更好的蛋白，構(gòu)建了真核表達(dá)載體pPIC9K-TsCL-1，電轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，將所有在營(yíng)養(yǎng)缺陷型選擇培養(yǎng)基MD上生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化子，采用G418濃度梯度進(jìn)行篩選，獲得了高拷貝重組菌株，PCR檢測(cè)表明有目的基因的整合；用0.5％甲醇誘導(dǎo)表達(dá)重組菌株，通過(guò)SDS-PAGE和Western-blotting對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行分析，結(jié)果表明T