猬迭宮絳蟲27kDa半胱氨酸蛋白酶基因原核表達條件優(yōu)化及組織定位研究.pdf

1、目的：
　　克隆、表達猬迭宮絳蟲27kDa半胱氨酸蛋白酶（Cysteine Protease，CP）基因，優(yōu)化原核表達條件，并應用免疫熒光技術檢測27kDa-CP在成蟲、裂頭蚴不同組織中的分布情況。
　　方法:
　?、俑鶕?jù)NCBI中公布的猬裂頭蚴27kDa半胱氨酸蛋白酶基因序列（27kDa-CP，D63670），提取蛇源猬裂頭蚴總RNA，逆轉錄合成cDNA，應用PCR技術對目的片段進行體外擴增，并克隆入原核表達載體pE

2、T-28a(+)，構建pET-28a(+)-27kDa-CP重組質粒，轉入大腸埃希菌Transetta（DE3）中，觀察在不同培養(yǎng)時間、不同濃度異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）及不同培養(yǎng)溫度條件下27kDa-CP重組蛋白的表達情況。用鎳離子柱親和層析法純化目的蛋白，表達產(chǎn)物用SDS-PAGE及Western Blotting進行分析。②用純化后的重組27kDa-CP蛋白免疫小鼠，制備多克隆抗體（一抗），用異硫氰酸熒光素（FITC

3、）標記的羊抗小鼠IgG作為二抗，對27kDa-CP在猬迭宮絳蟲成蟲、裂頭蚴組織中的位置分布進行免疫熒光定位。
　　結果：
　?、賞ET-28a(+)-27kDa-CP重組質粒經(jīng) IPTG誘導后，蛋白在大腸埃希菌 Transetta（DE3）中成功表達，最適表達條件為：培養(yǎng)溫度30℃，IPTG濃度為0.3mmol/L，培養(yǎng)時間為18h。重組蛋白主要以包涵體形式表達，純化后測得其濃度為0.2 mg/mL。②純化后的重組蛋白經(jīng)We

4、stern Blotting檢測，其相對分子質量大?。∕r）約為35kDa，與預期大小相符，且能被重組蛋白免疫小鼠血清識別。③免疫熒光定位顯示27kDa-CP在裂頭蚴皮層及排泄管中呈高度表達；在成蟲中，以節(jié)片（孕節(jié)和成節(jié)）子宮內(nèi)蟲卵卵殼的表達最強，其次為排泄管道及皮層。
　　結論：
　　①成功構建了猬迭宮絳蟲27kDa-CP基因原核表達體系，通過表達條件的優(yōu)化，在大腸埃希菌Transetta（DE3）中27kDa-CP重組蛋