基于RNA-seq技術(shù)對猬迭宮絳蟲轉(zhuǎn)錄組的研究.pdf

1、目的：構(gòu)建貴州省安順地區(qū)蛇源猬迭宮絳蟲成蟲及裂頭蚴轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，分析成蟲與幼蟲時期基因表達(dá)情況及差異,期望揭示猬迭宮絳蟲的轉(zhuǎn)錄組遺傳信息，為進一步研究該絳蟲奠定基礎(chǔ)。
　　方法:①采集安順地區(qū)王錦蛇源裂頭蚴，用裂頭蚴感染幼犬5只（10條/只），一月后解剖幼犬，小腸內(nèi)收集成蟲。②用 TRIzol法分別提取成蟲和裂頭蚴的總 RNA，使用 Oligo dT磁珠純化及分離mRNA，繼而對mRNA片段化處理，反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cDNA，構(gòu)建轉(zhuǎn)錄

2、組測序文庫。采用Solexa RNA－paired-end方法對成蟲及裂頭蚴cDNA文庫進行測序。③用Trinity軟件進行組裝與拼接，獲得unigene。利用生物信息學(xué)方法對所得的unigene進行注釋，包括與蛋白序列數(shù)據(jù)庫 NR、Swiss-Prot、GO、KEGG和KOG做blastx比對，得到具有最高序列相似性的蛋白，從而得到該 unigene的蛋白功能注釋信息。④根據(jù)數(shù)據(jù)庫中基因表達(dá)量(FPKM值)篩選成蟲及幼蟲高表達(dá)基因,根

3、據(jù)基因表達(dá)量比值倍數(shù)的關(guān)系篩選成蟲及幼蟲差異表達(dá)基因及非差異表達(dá)基因。
　　結(jié)果:①成蟲共得到60,646,568個原始序列、平均序列長度為101 bp，經(jīng)過嚴(yán)格的過濾處理和質(zhì)控,保留了58779813個高質(zhì)量的干凈序列、可用序列比例為96.92％、Mapping reads的比例為92.01%，測序質(zhì)量評估Q20值為94.70%；裂頭蚴共得到50740016個原始序列、平均序列長度為101 bp，經(jīng)過濾保留了47584667個干

4、凈序列、可用序列比例為93.78%、Mapping reads的比例為85.70%，Q20值為92.14%；②通過Trinity軟件組裝，檢測樣本共得到44047個unigene，平均長度為655.94 bp，成蟲及裂頭蚴基因的表達(dá)豐度分別為67.83%和74.52%；③將樣本Unigene與公共數(shù)據(jù)庫中基因進行比對。比對到 NR數(shù)據(jù)庫中的unigene為13954條，占總unigene（44047）的31.68%；④對unigene進

5、行KOG功能分類預(yù)測，共有7840個基因被注釋上25種KOG分類；⑤通過對KEGG注釋，共1786個基因注釋到了KEGG代謝通路中，參與了5大類生物過程（有機系統(tǒng)、代謝途徑、遺傳學(xué)過程、環(huán)境信息過程、細(xì)胞代謝過程）的代謝，共322個代謝通路。該樣本注釋上基因最多的有5個pathway，共有852條unigene參與，占被注釋的基因的47.7%（852/1786），這5個代謝通路的KO號分別為ko03010（參與的unigenes為221

6、條）、ko05016（參與的基因有176條）、ko00190（參與的基因有154條）、ko03040（參與的基因有152條）和ko05010（參與的基因有149條），其中43.8%（373/852）與遺傳學(xué)過程有關(guān)，18.1%(154/852)與代謝途徑有關(guān)，38.1%（325/852）人類疾病有關(guān)。⑥成蟲相對于裂頭蚴，具有3299個差異性表達(dá)基因，其中上調(diào)基因1850個，下調(diào)基因1449個。通過Blast2 GO軟件對差異表達(dá)基因進行

7、富集分析，具有顯著性差異的基因數(shù)為655個，采用 KOBAS網(wǎng)站上提供的超幾何檢驗的統(tǒng)計學(xué)方法以基因組顯背景進行差異表達(dá)基因的Pathway富集分析，發(fā)現(xiàn)具有顯著性差異的基因數(shù)為41個，部分極其顯著的GO條目和Pathway通路均為10個。
　　結(jié)論：①高通量的測序技術(shù)（Illumina HiseqTM2000i測序儀）可以滿足猬迭宮絳蟲轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析的要求，其覆蓋度、測序深度、測序的準(zhǔn)確度都可以得到保證，為今后 RNA水平的研究提

8、供了有力的技術(shù)支持，為進一步研究該絳蟲功能基因組、遺傳機制、新陳代謝以及發(fā)現(xiàn)與免疫表達(dá)相關(guān)的新基因和分子標(biāo)記等提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。②猬迭宮絳蟲轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫NR、SwissProt、KEGG和KOG比對得到的蛋白注釋信息，通過包括KOG功能注釋，GO功能分類注釋、KEGG代謝通路的分析，獲得了猬迭宮絳蟲基因產(chǎn)物的直系同源性、基因功能分類以及基因產(chǎn)物在迭宮絳蟲中的代謝途徑等信息。③通過比對發(fā)現(xiàn)猬迭宮絳蟲的成蟲和裂頭蚴的基因表達(dá)量