基于RNA-seq的玉米CMS-C花藥可變剪接和新轉(zhuǎn)錄本的分析.pdf

1、玉米是主要的糧、飼、經(jīng)三元作物，總產(chǎn)量居世界首位，是最早利用雄性不育生產(chǎn)雜交種的作物。不育化制種能提高制種純度，保持雜種優(yōu)勢(shì)，節(jié)約勞動(dòng)力。采用RNA-seq技術(shù)，以玉米C型不育系C48-2及保持系N48-2花藥為材料，B73為參考基因組，從轉(zhuǎn)錄組水平對(duì)玉米C48-2、N48-2的可變剪接(alternative splicing，AS)事件和新轉(zhuǎn)錄本(Novel TU)進(jìn)行了分析，主要研究結(jié)果如下:
　　1.基于RNA-seq數(shù)據(jù)

2、，C48-2中總共在5721個(gè)基因中檢測(cè)到12596個(gè)可變剪接事件，具有可變剪接的基因占玉米B73基因總數(shù)的18.85％; N48-2中總共在4554個(gè)基因中檢測(cè)到8747個(gè)可變剪接事件，占B73基因總數(shù)的14.67％。其中，內(nèi)含子保留(retained intron，RI)和可變的3'端外顯子(Alternative3'splice site，A3SS)是兩種主要剪接類型，互相排斥的外顯子(Mutually Exclusive Exo

3、n，MXE)類型剪接事件未檢測(cè)到，可變的5'端外顯子(Alternative5'splice site，A5SS)、外顯子跳躍(ExonSkipping，ES)、可變的第一個(gè)外顯子(Alternative First Exon，AFE)和可變的最后一個(gè)外顯子(Alternative Last Exon，ALE)剪接類型所占比例較小?？勺兗艚油怙@子長(zhǎng)度分布統(tǒng)計(jì)表明可變剪接外顯子偏向于較小的外顯子。使用weblogo法對(duì)剪接位點(diǎn)序列信號(hào)分析

4、表明剪接位點(diǎn)序列非常保守。通過分析玉米中發(fā)生RI和外顯子剪接(cassette exon，CE)基因數(shù)目的比例，推測(cè)內(nèi)含子識(shí)別(intron definition，ID)和外顯子識(shí)別(exon definition，ED)機(jī)制在玉米基因中共同發(fā)揮作用。利用RT-PCR對(duì)內(nèi)含子保留(RI)和外顯子跳躍(Exon skipping，ES)兩種可變剪接事件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，結(jié)果表明，GRMZM2G076526基因的內(nèi)含子保留和GRMZM2G056

5、442基因的外顯子跳躍剪接事件是可靠的。
　　2.基于RNA-seq數(shù)據(jù)，在C48-2花藥中鑒定了2668條新轉(zhuǎn)錄本，N48-2花藥中鑒定了2376條新轉(zhuǎn)錄本。通過CPC軟件預(yù)測(cè)新轉(zhuǎn)錄本的編碼能力，C48-2中有1711個(gè)新轉(zhuǎn)錄本具有編碼能力，占總數(shù)的64.13％; N48-2中有1537個(gè)具有編碼能力的新轉(zhuǎn)錄本，占總數(shù)的64.68％。通過ESTscan軟件對(duì)編碼區(qū)(CDS)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，大多數(shù)新轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度較短，小于1000

6、bp的新轉(zhuǎn)錄本在C48-2中有1892條，占C48-2中新轉(zhuǎn)錄本總數(shù)的70.91％，N48-2中有1770條，占N48-2中新轉(zhuǎn)錄本總數(shù)的74.49％。隨機(jī)選取了C48-2中有功能的新轉(zhuǎn)錄本3個(gè)(TU850、TU855、TU1062)，N48-2中有功能的新轉(zhuǎn)錄本2個(gè)(TU751、TU1313)，利用RT-PCR對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果表明，新轉(zhuǎn)錄本TU850、TU855和TU1062在C48-2中真實(shí)存在，其中TU1062可能是C48-2中

7、的一個(gè)新基因。新轉(zhuǎn)錄本TU751和TU1313在N48-2中真實(shí)存在，其中TU751可能是一個(gè)融合轉(zhuǎn)錄本。
　　3.用C48-2和N48-2花藥中發(fā)生了可變剪接但剪接位點(diǎn)不一致且差異表達(dá)的基因做韋恩圖，得到了562個(gè)候選基因，用562個(gè)候選基因的964條轉(zhuǎn)錄本比對(duì)到GO數(shù)據(jù)庫，全部得到GO term，使用Blast2go軟件進(jìn)行GO功能富集分析，結(jié)果顯示，細(xì)胞組分(Cellular component)包含了9個(gè)功能分類，分子功能

8、（Molecular function）包含了11個(gè)功能分類，生物學(xué)過程(Biological process)包含了24個(gè)功能分類。
　　4.將C48-2中有編碼能力的1711個(gè)新轉(zhuǎn)錄本，N48-2中有編碼能力的1537個(gè)新轉(zhuǎn)錄本比對(duì)到Nr數(shù)據(jù)庫，物種分布統(tǒng)計(jì)玉米中最多，高粱中次之。進(jìn)一步將具有編碼能力的新轉(zhuǎn)錄本比對(duì)GO數(shù)據(jù)庫，全部得到GO term，使用Blast2go軟件進(jìn)行GO功能富集分析，結(jié)果顯示，細(xì)胞組分(Cellul