水貂被毛色素沉積機理及基于高通量RNA-seq皮膚轉錄組注釋研究.pdf

1、水貂（Neovison vison），是一種珍貴毛皮動物，其毛皮主要用于制裘，因此，被毛顏色是決定貂皮質量與價值的一種重要經濟性狀，深入解析水貂被毛色素沉積機理在新型毛色品種培育過程中具有重要的理論與實踐意義。為了更好地明確水貂被毛顏色表型形成的遺傳調控機制，本研究以具有顯著毛色差異的金州黑水貂（黑色）、吉林白水貂（白色）、銀藍水貂（灰色）、咖啡水貂（棕褐色）和珍珠水貂（珍珠色）為研究對象，利用組織學、細胞學、分子生物學及高通量RNA-

2、seq轉錄組測序技術，系統(tǒng)開展了水貂被毛黑色素含量差異分析、成熟黑色素細胞組織學定位檢測、毛色關聯(lián)基因克隆及其遺傳變異位點篩查、毛色基因mRNA差異表達分析與基于高通量RNA-seq皮膚轉錄組挖掘色素沉積相關基因等六個相互關聯(lián)的試驗研究，主要研究內容及獲得的研究結果如下：
　　1．通過測定換毛期和毛皮成熟期金州黑水貂、銀藍水貂和吉林白水貂被毛黑色素含量，比較3種不同被毛顏色水貂毛纖維中總黑色素（Total melanin，TM）、

3、真黑色素（Eumelanin，EM）及褐黑色素（Pheomelanin，PM）含量的差異，同時分析不同時期被毛黑色素含量的變化。結果表明，換毛期和毛皮成熟期，黑色水貂被毛TM、EM和PM含量均最高，隨著被毛顏色變淺，3種黑色素含量均呈降低趨勢。單因素方差分析顯示，黑色水貂中，毛皮成熟期被毛TM和PM含量分別是換毛期的1.17和1.20倍（P<0.01），EM含量顯著高于換毛期（P<0.05）；白色水貂毛皮成熟期被毛TM和PM含量分別是換

4、毛期的1.27和1.22倍（P<0.05），EM含量略高于換毛期，差異不顯著（P>0.05）；銀藍水貂被毛TM、EM和 PM含量在毛皮成熟期和換毛期差異不顯著（P>0.05）。PM含量決定了水貂灰色和白色被毛表型的發(fā)生，EM含量可能與黑色被毛表型存在關聯(lián)，在水貂換毛過程中，存在于皮膚黑色素小體中的黑色素由毛囊定向轉移到毛干。
　　2．利用甲苯胺藍染色、多巴氧化酶法（dopa）及dopa-甲苯胺藍聯(lián)合染色三種方法，分析黑色、灰色和白

5、色被毛水貂皮膚組織中成熟黑色素細胞的分布特性。甲苯胺藍染色結果表明，3種毛色水貂皮膚、毛囊及其附屬物結構特征比較明顯，其中有核細胞的細胞核被染成藍色，毛皮成熟期水貂表皮相對真皮較薄，毛根下端形成杵狀毛（club hair），未見明顯凹陷的毛乳頭，推斷水貂毛囊處于退行期（catagen）后期。dopa染色與dopa-甲苯胺藍復染鏡檢結果均顯示，黑色水貂表皮多巴陽性著色較灰色水貂深，且黑色素顆粒呈連續(xù)分布，灰色水貂表皮陽性著色區(qū)域顏色較淺，

6、呈間斷分布。多巴陽性呈“團狀”大量聚集于黑色被毛水貂皮膚毛囊頂端，毛囊外根鞘和毛根的髓質中有少量著色帶，沿毛干方向，顏色逐漸變淡；灰色被毛毛囊頂端多巴陽性著色帶較少，呈“稀疏顆?！狈植迹彝飧赎栃灾^黑色被毛弱。白色被毛水貂皮膚組織中未見明顯多巴陽性著色區(qū)域。毛囊頂端的成熟黑色素細胞是水貂被毛色素沉積的主要細胞學基礎，該部位成熟黑色素細胞數量及酪氨酸酶活性是決定其毛色差異的直接因素，表皮中的黑色素細胞可能并不參與水貂被毛色素沉積。

7、
　　3．采用PCR、克隆測序技術獲得水貂MC1R、TYR和Agouti基因核苷酸序列，通過比較基因組學方法對3個基因進行了鑒定及生物信息學分析。結果表明，美洲水貂 MC1R基因長度為1324 bp（GenBank登錄號：KJ152766），編碼序列長954 bp，編碼317個氨基酸，MC1R蛋白多肽鏈存在1個低復雜度結構域和7個典型跨膜區(qū)，具有細胞膜受體典型結構。水貂 TYR基因（GenBank登錄號：KJ716783）5個完整

8、的外顯子長度分別為：819 bp（外顯子1）、217 bp（外顯子2）、148 bp（外顯子3）、182 bp（外顯子4）和230 bp（外顯子5），編碼區(qū)全長1596 bp，編碼531個氨基酸，由18個氨基酸的信號肽和513個氨基酸的成熟肽組成。水貂Agouti基因長度為4231 bp，包括部分內含子1（424 bp）、完整外顯子2（160 bp）、外顯子3（62 bp）、內含子2（1256 bp）和部分內含子3（2329 bp）。<

9、br>　　4．采集金州黑水貂、銀藍水貂、吉林白水貂、咖啡水貂和珍珠色水貂共計430份血液，利用PCR產物直接測序技術對MC1R、TYR和Agouti基因編碼區(qū)及非編碼區(qū)開展SNPs檢測，將不同基因突變位點形成的基因型與水貂毛色表型進行了關聯(lián)分析。結果表明，水貂MC1R基因編碼區(qū)不存在多態(tài)性，編碼區(qū)上游存在缺失突變位點：g.132_135delAGTG，銀藍水貂在該位點的多態(tài)信息含量為0.3268，屬中度多態(tài)，暗示該突變位點可能影響銀藍水

10、貂的被毛顏色，或者與調控銀藍水貂灰色被毛表型的主效基因連鎖。TYR基因外顯子4和5不具有多態(tài)性，外顯子1無義SNPs（g.138T>A）與吉林白水貂白色被毛表型極顯著相關（P<0.0001）。Agouti基因內含子2中g.1189C>T位點的CT基因型與吉林白水貂白色被毛表型存在關聯(lián)；內含子3上g.252C>T位點CT基因型與珍珠水貂的毛色存在關聯(lián)，5個SNPs（g.290A>C、g.298G>C、g.340A>G、g.343T>C和g

11、.379T>C）與2個缺失突變位點（g.472_473delCA和g.974_977delCTCT）在不同毛色水貂群體內分別處于緊密連鎖狀態(tài)且可能與水貂淺色被毛表型相關。
　　5．采用qRT-PCR技術分析了金州黑水貂、銀藍水貂和吉林白水貂毛皮成熟期背部皮膚組織MC1R、TYR和Agouti基因mRNA表達量。結果表明，毛皮成熟期，3個基因在3種毛色水貂皮膚中均有表達。在MC1R基因mRNA表達上，白色與黑色、灰色差異極顯著（P<

12、0.01），黑色與灰色差異不顯著（P>0.05），相對表達量順序為：白色>灰色>黑色。黑色、灰色被毛水貂TYR基因mRNA表達量分別是白色被毛水貂的3.2535和1.8933倍，黑色與灰色、白色被毛水貂差異極顯著（P<0.01），相對表達量順序為：黑色>灰色>白色。黑色、灰色被毛水貂Agouti基因mRNA表達量分別是白色被毛水貂的1.2515和0.9501倍，但三者間差異不顯著（P>0.05），相對表達量順序為：黑色>白色>灰色。

13、r>　　6．基于高通量RNA-seq技術測定了金州黑水貂、銀藍水貂和吉林白水貂皮膚組織轉錄組，利用qRT-PCR技術對可能影響水貂被毛色素沉積的關鍵基因進行了mRNA定量表達驗證。結果表明，獲得毛皮成熟期水貂皮膚轉錄組原始數據約33.19 G，403,725個Unigene成功注釋到7個生物信息學數據庫中。BLM_Svs WHM_S（黑色vs白色）、BLM_S vs SBM_S（黑色vs灰色）和WHM_S vs SBM_S（白色vs灰色