水貂被毛色素沉積機(jī)理及基于高通量RNA-seq皮膚轉(zhuǎn)錄組注釋研究.pdf

1、水貂（Neovison vison），是一種珍貴毛皮動(dòng)物，其毛皮主要用于制裘，因此，被毛顏色是決定貂皮質(zhì)量與價(jià)值的一種重要經(jīng)濟(jì)性狀，深入解析水貂被毛色素沉積機(jī)理在新型毛色品種培育過程中具有重要的理論與實(shí)踐意義。為了更好地明確水貂被毛顏色表型形成的遺傳調(diào)控機(jī)制，本研究以具有顯著毛色差異的金州黑水貂（黑色）、吉林白水貂（白色）、銀藍(lán)水貂（灰色）、咖啡水貂（棕褐色）和珍珠水貂（珍珠色）為研究對(duì)象，利用組織學(xué)、細(xì)胞學(xué)、分子生物學(xué)及高通量RNA-

2、seq轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，系統(tǒng)開展了水貂被毛黑色素含量差異分析、成熟黑色素細(xì)胞組織學(xué)定位檢測(cè)、毛色關(guān)聯(lián)基因克隆及其遺傳變異位點(diǎn)篩查、毛色基因mRNA差異表達(dá)分析與基于高通量RNA-seq皮膚轉(zhuǎn)錄組挖掘色素沉積相關(guān)基因等六個(gè)相互關(guān)聯(lián)的試驗(yàn)研究，主要研究內(nèi)容及獲得的研究結(jié)果如下：
　　1．通過測(cè)定換毛期和毛皮成熟期金州黑水貂、銀藍(lán)水貂和吉林白水貂被毛黑色素含量，比較3種不同被毛顏色水貂毛纖維中總黑色素（Total melanin，TM）、

3、真黑色素（Eumelanin，EM）及褐黑色素（Pheomelanin，PM）含量的差異，同時(shí)分析不同時(shí)期被毛黑色素含量的變化。結(jié)果表明，換毛期和毛皮成熟期，黑色水貂被毛TM、EM和PM含量均最高，隨著被毛顏色變淺，3種黑色素含量均呈降低趨勢(shì)。單因素方差分析顯示，黑色水貂中，毛皮成熟期被毛TM和PM含量分別是換毛期的1.17和1.20倍（P<0.01），EM含量顯著高于換毛期（P<0.05）；白色水貂毛皮成熟期被毛TM和PM含量分別是換

4、毛期的1.27和1.22倍（P<0.05），EM含量略高于換毛期，差異不顯著（P>0.05）；銀藍(lán)水貂被毛TM、EM和 PM含量在毛皮成熟期和換毛期差異不顯著（P>0.05）。PM含量決定了水貂灰色和白色被毛表型的發(fā)生，EM含量可能與黑色被毛表型存在關(guān)聯(lián)，在水貂換毛過程中，存在于皮膚黑色素小體中的黑色素由毛囊定向轉(zhuǎn)移到毛干。
　　2．利用甲苯胺藍(lán)染色、多巴氧化酶法（dopa）及dopa-甲苯胺藍(lán)聯(lián)合染色三種方法，分析黑色、灰色和白

5、色被毛水貂皮膚組織中成熟黑色素細(xì)胞的分布特性。甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果表明，3種毛色水貂皮膚、毛囊及其附屬物結(jié)構(gòu)特征比較明顯，其中有核細(xì)胞的細(xì)胞核被染成藍(lán)色，毛皮成熟期水貂表皮相對(duì)真皮較薄，毛根下端形成杵狀毛（club hair），未見明顯凹陷的毛乳頭，推斷水貂毛囊處于退行期（catagen）后期。dopa染色與dopa-甲苯胺藍(lán)復(fù)染鏡檢結(jié)果均顯示，黑色水貂表皮多巴陽性著色較灰色水貂深，且黑色素顆粒呈連續(xù)分布，灰色水貂表皮陽性著色區(qū)域顏色較淺，

6、呈間斷分布。多巴陽性呈“團(tuán)狀”大量聚集于黑色被毛水貂皮膚毛囊頂端，毛囊外根鞘和毛根的髓質(zhì)中有少量著色帶，沿毛干方向，顏色逐漸變淡；灰色被毛毛囊頂端多巴陽性著色帶較少，呈“稀疏顆?！狈植?，毛囊外根鞘陽性著色較黑色被毛弱。白色被毛水貂皮膚組織中未見明顯多巴陽性著色區(qū)域。毛囊頂端的成熟黑色素細(xì)胞是水貂被毛色素沉積的主要細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)，該部位成熟黑色素細(xì)胞數(shù)量及酪氨酸酶活性是決定其毛色差異的直接因素，表皮中的黑色素細(xì)胞可能并不參與水貂被毛色素沉積。

7、
　　3．采用PCR、克隆測(cè)序技術(shù)獲得水貂MC1R、TYR和Agouti基因核苷酸序列，通過比較基因組學(xué)方法對(duì)3個(gè)基因進(jìn)行了鑒定及生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明，美洲水貂 MC1R基因長度為1324 bp（GenBank登錄號(hào)：KJ152766），編碼序列長954 bp，編碼317個(gè)氨基酸，MC1R蛋白多肽鏈存在1個(gè)低復(fù)雜度結(jié)構(gòu)域和7個(gè)典型跨膜區(qū)，具有細(xì)胞膜受體典型結(jié)構(gòu)。水貂 TYR基因（GenBank登錄號(hào)：KJ716783）5個(gè)完整

8、的外顯子長度分別為：819 bp（外顯子1）、217 bp（外顯子2）、148 bp（外顯子3）、182 bp（外顯子4）和230 bp（外顯子5），編碼區(qū)全長1596 bp，編碼531個(gè)氨基酸，由18個(gè)氨基酸的信號(hào)肽和513個(gè)氨基酸的成熟肽組成。水貂Agouti基因長度為4231 bp，包括部分內(nèi)含子1（424 bp）、完整外顯子2（160 bp）、外顯子3（62 bp）、內(nèi)含子2（1256 bp）和部分內(nèi)含子3（2329 bp）。<

9、br>　　4．采集金州黑水貂、銀藍(lán)水貂、吉林白水貂、咖啡水貂和珍珠色水貂共計(jì)430份血液，利用PCR產(chǎn)物直接測(cè)序技術(shù)對(duì)MC1R、TYR和Agouti基因編碼區(qū)及非編碼區(qū)開展SNPs檢測(cè)，將不同基因突變位點(diǎn)形成的基因型與水貂毛色表型進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果表明，水貂MC1R基因編碼區(qū)不存在多態(tài)性，編碼區(qū)上游存在缺失突變位點(diǎn)：g.132_135delAGTG，銀藍(lán)水貂在該位點(diǎn)的多態(tài)信息含量為0.3268，屬中度多態(tài)，暗示該突變位點(diǎn)可能影響銀藍(lán)水

10、貂的被毛顏色，或者與調(diào)控銀藍(lán)水貂灰色被毛表型的主效基因連鎖。TYR基因外顯子4和5不具有多態(tài)性，外顯子1無義SNPs（g.138T>A）與吉林白水貂白色被毛表型極顯著相關(guān)（P<0.0001）。Agouti基因內(nèi)含子2中g(shù).1189C>T位點(diǎn)的CT基因型與吉林白水貂白色被毛表型存在關(guān)聯(lián)；內(nèi)含子3上g.252C>T位點(diǎn)CT基因型與珍珠水貂的毛色存在關(guān)聯(lián)，5個(gè)SNPs（g.290A>C、g.298G>C、g.340A>G、g.343T>C和g

11、.379T>C）與2個(gè)缺失突變位點(diǎn)（g.472_473delCA和g.974_977delCTCT）在不同毛色水貂群體內(nèi)分別處于緊密連鎖狀態(tài)且可能與水貂淺色被毛表型相關(guān)。
　　5．采用qRT-PCR技術(shù)分析了金州黑水貂、銀藍(lán)水貂和吉林白水貂毛皮成熟期背部皮膚組織MC1R、TYR和Agouti基因mRNA表達(dá)量。結(jié)果表明，毛皮成熟期，3個(gè)基因在3種毛色水貂皮膚中均有表達(dá)。在MC1R基因mRNA表達(dá)上，白色與黑色、灰色差異極顯著（P<

12、0.01），黑色與灰色差異不顯著（P>0.05），相對(duì)表達(dá)量順序?yàn)椋喊咨?灰色>黑色。黑色、灰色被毛水貂TYR基因mRNA表達(dá)量分別是白色被毛水貂的3.2535和1.8933倍，黑色與灰色、白色被毛水貂差異極顯著（P<0.01），相對(duì)表達(dá)量順序?yàn)椋汉谏?灰色>白色。黑色、灰色被毛水貂Agouti基因mRNA表達(dá)量分別是白色被毛水貂的1.2515和0.9501倍，但三者間差異不顯著（P>0.05），相對(duì)表達(dá)量順序?yàn)椋汉谏?白色>灰色。

13、r>　　6．基于高通量RNA-seq技術(shù)測(cè)定了金州黑水貂、銀藍(lán)水貂和吉林白水貂皮膚組織轉(zhuǎn)錄組，利用qRT-PCR技術(shù)對(duì)可能影響水貂被毛色素沉積的關(guān)鍵基因進(jìn)行了mRNA定量表達(dá)驗(yàn)證。結(jié)果表明，獲得毛皮成熟期水貂皮膚轉(zhuǎn)錄組原始數(shù)據(jù)約33.19 G，403,725個(gè)Unigene成功注釋到7個(gè)生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫中。BLM_Svs WHM_S（黑色vs白色）、BLM_S vs SBM_S（黑色vs灰色）和WHM_S vs SBM_S（白色vs灰色