高通量RNA-seq測序數(shù)據(jù)的基因表達(dá)水平分析研究.pdf

1、近年來，新一代高通量DNA測序技術(shù)的快速發(fā)展，給人類研究基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)提供了巨大的技術(shù)支持，取得前所未有的成就?；谛乱淮鷾y序技術(shù)的RNA-seq技術(shù)，正快速取代傳統(tǒng)基因芯片技術(shù)，成為研究轉(zhuǎn)錄組學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)手段。RNA-seq測序技術(shù)直接對mRNA反轉(zhuǎn)錄出的cDNA片段進(jìn)行高通量的測序，獲得海量的讀段數(shù)據(jù)，用以研究測序樣本中mRNA的表達(dá)程度。相比傳統(tǒng)基因芯片技術(shù)，RNA-seq測序技術(shù)無需設(shè)計(jì)已知序列探針，能在全基因組范圍內(nèi)以單個(gè)

2、堿基為基本單位量化轉(zhuǎn)錄本片段，并能應(yīng)用于新基因的識別，具有高通量，高信噪比，高靈敏度，所需樣本少等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛運(yùn)用于不同研究領(lǐng)域。
　　在轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究中，基因表達(dá)水平分析主要研究基因以及所包含的剪接異構(gòu)體在轉(zhuǎn)錄過程中表達(dá)程度，對人們了解基因的調(diào)控機(jī)制，對疾病的早期預(yù)防，診斷和治療等方面都有重要意義。根據(jù)RNA-seq數(shù)據(jù)分析流程，基因表達(dá)分析的研究內(nèi)容可分為表達(dá)水平估計(jì)和差異表達(dá)分析兩部分。因此，本論文的主要工作是圍繞上述兩個(gè)方向

3、來展開研究和討論，主要內(nèi)容如下幾個(gè)方面：
　　1.基于堿基偏差的表達(dá)水平估計(jì)。表達(dá)水平估計(jì)作為RNA-seq數(shù)據(jù)分析中最基本實(shí)驗(yàn)?zāi)康闹?，一直以來都是一個(gè)具有挑戰(zhàn)性的工作。在RNA-seq數(shù)據(jù)中，數(shù)據(jù)偏差導(dǎo)致基因上讀段呈現(xiàn)非均勻分布，是影響表達(dá)水平準(zhǔn)確估計(jì)的關(guān)鍵因素。針對此問題，大量表達(dá)水平估計(jì)方法采用不同偏差糾錯(cuò)的策略來消除數(shù)據(jù)偏差的影響。因此，提出了一個(gè)基于堿基偏差的表達(dá)水平估計(jì)方法——PBSeq。該方法采用Poisson分布

4、擬合每個(gè)堿基上的讀段數(shù)據(jù)。通過兩個(gè)非參數(shù)模型分別估計(jì)每個(gè)堿基上的位置偏差和序列偏差，將偏差值當(dāng)做權(quán)重融入到模型中。通過一個(gè)模擬數(shù)據(jù)集和多個(gè)真實(shí)數(shù)據(jù)集的評估，PBSeq方法在估計(jì)基因和剪接異構(gòu)體表達(dá)水平上，能獲得極具競爭力的結(jié)果，并且大幅度的提高了計(jì)算效率。PBSeq方法不僅能估計(jì)基因和剪接異構(gòu)體的表達(dá)水平，同時(shí)還能提供相應(yīng)表達(dá)水平的不確定性。通過差異表達(dá)分析的驗(yàn)證，表達(dá)水平的不確定性能有效的提高后續(xù)分析的準(zhǔn)確性。
　　2.基于聯(lián)合

5、估計(jì)外顯子偏差的表達(dá)水平估計(jì)。RNA-seq數(shù)據(jù)在不同條件或者不同組織樣本中，其讀段分布的變化趨勢具有高度相似性。但是現(xiàn)有表達(dá)水平估計(jì)方法中很少考慮到數(shù)據(jù)偏差在不同樣本之間的關(guān)聯(lián)，通常都是單獨(dú)處理每個(gè)數(shù)據(jù)樣本?；诖藬?shù)據(jù)特點(diǎn)，提出了一個(gè)基于聯(lián)合估計(jì)外顯子偏差的表達(dá)水平估計(jì)方法——PGSeq。該方法采用Poisson-Gamma混合模型來估計(jì)基因和剪接異構(gòu)體的表達(dá)水平，其中Poisson分布用來擬合基因中每個(gè)外顯子上的讀段數(shù)據(jù)。Gamma

6、分布用來模擬數(shù)據(jù)偏差，其參數(shù)在多個(gè)樣本之間是共享的，表示讀段分布的變化趨勢在不同樣本之間具有高度相似性。通過一個(gè)模擬數(shù)據(jù)集和多個(gè)真實(shí)數(shù)據(jù)集的評估，PGSeq方法能最為準(zhǔn)確的估計(jì)基因和剪接異構(gòu)體的表達(dá)水平，并且也能提供了相應(yīng)表達(dá)水平的不確定性。采用差異表達(dá)分析進(jìn)一步驗(yàn)證，PGSeq方法估計(jì)的表達(dá)水平以及相應(yīng)的不確定性能有效提高差異表達(dá)分析的準(zhǔn)確性，特別是在低表達(dá)基因上。
　　3.基于表達(dá)水平不確定性的差異表達(dá)分析。作為RNA-seq

7、數(shù)據(jù)分析中最基本實(shí)驗(yàn)?zāi)康闹坏牟町惐磉_(dá)分析，受到科研人員的格外關(guān)注。在目前大量的差異表達(dá)分析方法中，很少有方法考慮表達(dá)水平不確定性。此外，絕大部分方法僅能檢測差異表達(dá)的基因，只有少數(shù)方法能夠檢測差異表達(dá)的剪接異構(gòu)體。因此，提出了一個(gè)基于貝葉斯框架的差異表達(dá)分析方法——BDSeq。該方法同時(shí)考慮了表達(dá)水平以及相應(yīng)的表達(dá)水平不確定性，能夠同時(shí)尋找差異表達(dá)的基因和剪接異構(gòu)體。BDSeq方法采用兩種不同的建模策略來嵌入表達(dá)水平的不確定性，從而產(chǎn)

8、生了兩個(gè)不同的模型——基本模型BDSeqB和快速模型BDSeqF。通過多個(gè)真實(shí)數(shù)據(jù)集的評估，考慮表達(dá)水平不確定性能有效提高差異表達(dá)分析的準(zhǔn)確性，其中BDSeqB模型能獲得更準(zhǔn)確的結(jié)果，但是BDSeqF具有更高的計(jì)算效率。
　　4.RNA-seq數(shù)據(jù)分析通道。為了方便用戶使用本論文提出的方法，設(shè)計(jì)了一個(gè)系統(tǒng)的RNA-seq數(shù)據(jù)分析通道——UFP-RSeq。該分析通道包括讀段定位，表達(dá)水平估計(jì)和差異表達(dá)分析三個(gè)模塊，能完成一個(gè)RNA-

9、seq數(shù)據(jù)的基因表達(dá)水平分析過程。讀段定位模塊選取了最流行的定位軟件Bowtie。表達(dá)水平估計(jì)模塊中包含了提出的GamSeq，PBSeq和PGSeq三個(gè)方法。而差異表達(dá)分析模塊中由BDSeq方法和三個(gè)基于讀段數(shù)據(jù)的方法構(gòu)成。根據(jù)用戶需求和實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)，提供了相應(yīng)的建議來幫助用戶選擇合適的處理途徑和方法。UFP-RSeq分析通道中所有方法都提供了代碼和詳細(xì)文檔，從地址http://parnec.nuaa.edu.cn/liux/UFP-RSe

10、q.html上可免費(fèi)下載。
　　綜上所述，本論文著重研究了在RNA-seq數(shù)據(jù)中基因表達(dá)水平分析的表達(dá)水平估計(jì)和差異表達(dá)分析兩個(gè)研究方向。在表達(dá)水平估計(jì)中，對于數(shù)據(jù)偏差造成的讀段非均勻分布問題，逐步提出了GamSeq，PBSeq和PGSeq等方法。在差異表達(dá)分析中提出了BDSeq方法，該方法基于提出的表達(dá)水平估計(jì)方法的結(jié)果，并考慮了表達(dá)水平不確定性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，我們提出的多個(gè)方法都取得理想的計(jì)算精度和計(jì)算效率。為了方便用戶使用，