玉米高通量測序數據SNP檢測流程的優(yōu)化及應用.pdf

1、單核苷酸多態(tài)性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）作為第三代分子標記，具有分布豐富、穩(wěn)定遺傳、快速檢測等特點，在分子標記輔助選擇、種子純度鑒定、目標基因定位、遺傳圖譜構建和全基因組關聯分析(Genome Wide Association Study,GWAS)等方面均具有廣泛的應用。玉米經過長期的自然選擇與人工馴化，形成了豐富的遺傳變異，已成為作物遺傳學研究的經典模式植物。然而，其基因組中大量重復序列

2、和轉座子的存在也為玉米變異檢測帶來了困難與挑戰(zhàn)。
　　為揭示不同SNP檢測流程、測序覆蓋度及測序讀長對玉米SNP檢測結果的影響，本研究利用玉米基因組的堿基編碼分布、GC偏好性等特征模擬不同覆蓋度及測序讀長的高通量測序數據，分別利用4個流程SAMtools、GATK-UnifiedGenotyper、VarScan和FreeBayes進行SNP檢測，進一步從SNP檢出率、假陽性率、程序運行效率等方面綜合比較不同覆蓋度、測序讀長以及不

3、同檢測流程對玉米SNP檢測效率的影響，從而獲得玉米SNP檢測的最佳流程和較高的“價效比”測序組合。
　　首先，本研究利用pIRS程序根據玉米參考基因組序列構建了玉米特征譜，模擬了不同覆蓋度和不同讀長的Illumina測序數據，隨后使用4種不同流程進行SNP檢測。結果發(fā)現，VarScan、SAMtools和GATK-UnifiedGenotyper流程SNP檢測正確率較高，而FreeBayes流程假陽性率較高。在低覆蓋度（＜8倍）時

4、，SAMtools與GATK-UnifiedGenotyper的正確率較高，然而，SAMtools流程的SNP檢出率較之后者高約15％;當覆蓋度在8倍及以上時，FreeBayes、SAMtools和GATK-UnifiedGenotyper流程SNP檢出率較高，而VarScan流程SNP檢出率則較低;在較高覆蓋度（≥30倍）時，4個流程的SNP檢出率趨于一致。此外，在高覆蓋度下對4個不同流程的檢測數據進一步取交集，發(fā)現SNP檢測正確率可

5、高達99.98％。因此，低覆蓋度（＜8倍）下，利用SAMtools流程檢測較為適宜;而中高覆蓋度（≥8倍）下，不同檢測程序均保持較高的檢出率和正確率，其中GATK-UnifiedGenotyper流程有較佳的性能表現，對不同檢測結果進行交集處理可進一步提高SNP檢測的準確率。
　　其次，相應的最優(yōu)流程對不同覆蓋度和不同讀長數據的SNP檢測結果表明，在玉米中，雙端100 bp(basepair)長、15倍覆蓋度測序組合，GATK-U

6、nifiedGenotyper流程的SNP檢出率約為85.9％，正確率約為99.84％;雙端150 bp長、8倍覆蓋度測序組合，GATK-UnifiedGenotyper流程的SNP檢出率約為86.4％，正確率約為99.92％;雙端250 bp長、5倍覆蓋度測序組合，SAMtools流程SNP檢出率約為81.6％，正確率約為99.82％。因此，采用雙端150bp測序長度、8倍覆蓋度測序組合可得到玉米SNP檢測的較高“價效比”。
　

7、　為了進一步驗證玉米優(yōu)化的SNP檢測流程的可靠性，本研究分別利用VarScan流程和中高覆蓋度較優(yōu)流程GATK-UnifiedGenotyper對玉米自交系H99(Paired-end100×2 bp，～11x)重測序數據進行了SNP檢測，分別檢測到4，878，937個SNP和6，885，936個SNP。隨后，從檢測結果中選取GATK-UnifiedGenotyper流程檢測，而VarScan流程未檢測到的SNP位點設計引物并測序驗證。