玉米高通量測(cè)序數(shù)據(jù)SNP檢測(cè)流程的優(yōu)化及應(yīng)用.pdf

1、單核苷酸多態(tài)性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）作為第三代分子標(biāo)記，具有分布豐富、穩(wěn)定遺傳、快速檢測(cè)等特點(diǎn)，在分子標(biāo)記輔助選擇、種子純度鑒定、目標(biāo)基因定位、遺傳圖譜構(gòu)建和全基因組關(guān)聯(lián)分析(Genome Wide Association Study,GWAS)等方面均具有廣泛的應(yīng)用。玉米經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的自然選擇與人工馴化，形成了豐富的遺傳變異，已成為作物遺傳學(xué)研究的經(jīng)典模式植物。然而，其基因組中大量重復(fù)序列

2、和轉(zhuǎn)座子的存在也為玉米變異檢測(cè)帶來(lái)了困難與挑戰(zhàn)。
　　為揭示不同SNP檢測(cè)流程、測(cè)序覆蓋度及測(cè)序讀長(zhǎng)對(duì)玉米SNP檢測(cè)結(jié)果的影響，本研究利用玉米基因組的堿基編碼分布、GC偏好性等特征模擬不同覆蓋度及測(cè)序讀長(zhǎng)的高通量測(cè)序數(shù)據(jù)，分別利用4個(gè)流程SAMtools、GATK-UnifiedGenotyper、VarScan和FreeBayes進(jìn)行SNP檢測(cè)，進(jìn)一步從SNP檢出率、假陽(yáng)性率、程序運(yùn)行效率等方面綜合比較不同覆蓋度、測(cè)序讀長(zhǎng)以及不

3、同檢測(cè)流程對(duì)玉米SNP檢測(cè)效率的影響，從而獲得玉米SNP檢測(cè)的最佳流程和較高的“價(jià)效比”測(cè)序組合。
　　首先，本研究利用pIRS程序根據(jù)玉米參考基因組序列構(gòu)建了玉米特征譜，模擬了不同覆蓋度和不同讀長(zhǎng)的Illumina測(cè)序數(shù)據(jù)，隨后使用4種不同流程進(jìn)行SNP檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，VarScan、SAMtools和GATK-UnifiedGenotyper流程SNP檢測(cè)正確率較高，而FreeBayes流程假陽(yáng)性率較高。在低覆蓋度（＜8倍）時(shí)

4、，SAMtools與GATK-UnifiedGenotyper的正確率較高，然而，SAMtools流程的SNP檢出率較之后者高約15％;當(dāng)覆蓋度在8倍及以上時(shí)，F(xiàn)reeBayes、SAMtools和GATK-UnifiedGenotyper流程SNP檢出率較高，而VarScan流程SNP檢出率則較低;在較高覆蓋度（≥30倍）時(shí)，4個(gè)流程的SNP檢出率趨于一致。此外，在高覆蓋度下對(duì)4個(gè)不同流程的檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)一步取交集，發(fā)現(xiàn)SNP檢測(cè)正確率可

5、高達(dá)99.98％。因此，低覆蓋度（＜8倍）下，利用SAMtools流程檢測(cè)較為適宜;而中高覆蓋度（≥8倍）下，不同檢測(cè)程序均保持較高的檢出率和正確率，其中GATK-UnifiedGenotyper流程有較佳的性能表現(xiàn)，對(duì)不同檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行交集處理可進(jìn)一步提高SNP檢測(cè)的準(zhǔn)確率。
　　其次，相應(yīng)的最優(yōu)流程對(duì)不同覆蓋度和不同讀長(zhǎng)數(shù)據(jù)的SNP檢測(cè)結(jié)果表明，在玉米中，雙端100 bp(basepair)長(zhǎng)、15倍覆蓋度測(cè)序組合，GATK-U

6、nifiedGenotyper流程的SNP檢出率約為85.9％，正確率約為99.84％;雙端150 bp長(zhǎng)、8倍覆蓋度測(cè)序組合，GATK-UnifiedGenotyper流程的SNP檢出率約為86.4％，正確率約為99.92％;雙端250 bp長(zhǎng)、5倍覆蓋度測(cè)序組合，SAMtools流程SNP檢出率約為81.6％，正確率約為99.82％。因此，采用雙端150bp測(cè)序長(zhǎng)度、8倍覆蓋度測(cè)序組合可得到玉米SNP檢測(cè)的較高“價(jià)效比”。
　

7、　為了進(jìn)一步驗(yàn)證玉米優(yōu)化的SNP檢測(cè)流程的可靠性，本研究分別利用VarScan流程和中高覆蓋度較優(yōu)流程GATK-UnifiedGenotyper對(duì)玉米自交系H99(Paired-end100×2 bp，～11x)重測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行了SNP檢測(cè)，分別檢測(cè)到4，878，937個(gè)SNP和6，885，936個(gè)SNP。隨后，從檢測(cè)結(jié)果中選取GATK-UnifiedGenotyper流程檢測(cè)，而VarScan流程未檢測(cè)到的SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物并測(cè)序驗(yàn)證。