基于聚丙烯酰胺凝膠的高通量SNP檢測芯片的研究及應(yīng)用.pdf

1、隨著人類基因組序列的繪制完成，生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點正迅速轉(zhuǎn)向?qū)蚬δ?、表達(dá)調(diào)控、多個基因間以及基因和環(huán)境間相互作用等方面。對基因組序列中單核苷酸多態(tài)性(single nucleotidepolymorphism，SNP)的研究是該階段的重要研究內(nèi)容之一。SNP作為第三代遺傳標(biāo)記，具有數(shù)量多、密度大、分布廣等特點，可用于疾病基因的定位與克隆、關(guān)聯(lián)分析等，并在疾病的早期診斷、預(yù)防和治療等方面體現(xiàn)重要功能和應(yīng)用價值。 SNP的

2、分型檢測技術(shù)種類繁多，各有利弊，探索和建立準(zhǔn)確、快速、高通量的SNP檢測方法仍然十分必要。DNA微陣列由于其平行性、高通量檢測等特點，在SNP分型上有很火的優(yōu)勢?；贒NA微陣列的SNP分型技術(shù)有兩種：一是將寡聚核苷酸固定在基片上檢測靶DNA中多個SNP位點：一是將靶DNA固定在基片上檢測大量樣本的某些特定位點。本論文在對第二種SNP檢測技術(shù)進(jìn)行優(yōu)化的基礎(chǔ)上，提出了一種新型的基于三維凝膠載體的DNA微陣列檢測SNP的分型技術(shù)，并將其應(yīng)用

3、于冠心病易感基因的研究中，主要內(nèi)容如下： 1. 基于二維DNA微陣列的SNP檢測技術(shù)的優(yōu)化 比較氨基、醛基、多聚賴氨酸三種不同玻片修飾方法，以及不同PCR產(chǎn)物長度的固定、雜交效率，結(jié)果表明，采用醛基修飾的玻片上固定200bp左右的PCR產(chǎn)物，具有較高的固定、雜交效率和信噪比。但這種二維DNA微陣列對PCR產(chǎn)物的需求量大，固一液相反應(yīng)效率較低，用于高通量SNP檢測還存在靈敏度、重復(fù)性、穩(wěn)定性等多方面的不足。

4、 2． 基于三維凝膠的SNP檢測芯片的制備與優(yōu)化 與傳統(tǒng)的二維核酸微陣列相比，凝膠DNA微陣列特有的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)可以固定更多的核酸分子，水凝膠載體提供類似于液相的反應(yīng)環(huán)境，可以作為良好的核酸同定載體進(jìn)行SNP檢測。我們采朋將丙烯酰胺修飾的PCR產(chǎn)物與丙烯酰胺單體等混合，點樣丁玻片上，在充滿TEMED的真空干燥器內(nèi)聚合成聚丙烯酰胺凝膠，制備三維凝膠的[)NA微陣列。與分別標(biāo)記Cy3、Cy5的熒光探針雜交，通過電泳清除非

5、特異性鍵合，可有效識別單堿基錯配。通過進(jìn)一步對聚丙烯酰胺凝膠濃度、產(chǎn)物變性方法、探針長度、電泳條件等進(jìn)行了一系列優(yōu)化，以及通用標(biāo)簽探針的應(yīng)川，建立了一種新型的基于三維凝膠DNA微陣列的SNP檢測技術(shù)，具有比二維芯片更理想的準(zhǔn)確性、靈敏度、穩(wěn)定性和重復(fù)性，并極大地降低了SNP檢測成本。 3． 基于凝膠的SNP檢測技術(shù)應(yīng)用于冠心病易感基因的研究 利用生物信息學(xué)篩選功能性SNPs，并應(yīng)用于冠心病研究中。我們初步篩選出

6、了OLRl、MMP-1、MMP-13、MMP-11、MMP-27和MMP-L1等6個基因的7個SNPs位點用于冠心病易感基因的研究?；谌S聚丙烯酰胺凝膠DNA微陣列技術(shù)，我們對238例冠心病患者和233例正常對照進(jìn)行SNPs分型檢測，并采用case-control方法進(jìn)行統(tǒng)計和遺傳學(xué)分析。結(jié)果顯示：將病人組按照生化指標(biāo)是否異常分組，在HDL<1.55 mmol/L和HDL≥1.55 mmol/L的女性冠心病人組間、LDL≥3.12 m