sds聚丙烯酰胺凝膠電泳原理（中）

1、,過硫酸銨-TEMED（四甲基乙二胺）系統(tǒng) ：在Acr 和Bis的溶液中放入這個催化系統(tǒng)后，過硫酸銨[（NH4）2S2O8]產(chǎn)生出游離氧原子使單體成為具有游離基的狀態(tài)，從而發(fā)生聚合作用。聚合的初速度和過硫酸銨濃度的平方根成正比。這種催化系統(tǒng)需要在堿性條件下進行。例如，在pH 8.8條件下7％的丙烯酰胺溶液30分鐘就能聚合完畢；在 pH 4.3時聚合很慢，要90分鐘才能完成。溫度與聚合的快慢成正比。通常在室溫下就很快聚合，溫度升高聚合更快

2、。如將混合后的凝膠溶液放在近0℃的地方，就能延緩聚合。一般來講，溫度過低，有氧分子或不純物質(zhì)存在時都能延緩凝膠的聚合。為了防止溶液中氣泡含有氧分子而妨礙聚合，在聚合前須將溶液分別抽氣，然后再混合。,最廣泛使用的不連續(xù)緩沖系統(tǒng)最早是由Ornstein(1964) 和Davis(1964) 設(shè)計的, 樣品和濃縮膠中含 Tris-HCl(pH 6.8), 上下槽緩沖液含Tris-甘氨酸(pH 8.3), 分離膠中含Tris-HCl(pH 8.

3、8)。系統(tǒng)中所有組分都含有0.1% 的 SDS(Laemmli, 1970)。樣品和濃縮膠中的氯離子形成移動界面的先導(dǎo)邊界而甘氨酸分子則組成尾隨邊界，在移動界面的兩邊界之間是一電導(dǎo)較低而電位滴度較陡的區(qū)域, 它推動樣品中的蛋白質(zhì)前移并在分離膠前沿積聚。此處pH值較高， 有利于甘氨酸的離子化，所形成的甘氨酸離子穿過堆集的蛋白質(zhì)并緊隨氯離子之后，沿分離膠泳動。從移動界面中解脫后，SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物成一電位和pH值均勻的區(qū)帶泳動穿過分離膠，

4、并被篩分而依各自的大小得到分離。,,,,甘氨酸,濃縮效應(yīng)：凝膠由兩種不同的凝膠層組成。上層為濃縮膠，下層為分離膠。濃縮膠為大孔膠，緩沖液pH6.7，分離膠為小孔膠，緩沖液pH8.9。在上下電泳槽內(nèi)充以Tris—甘氨酸緩沖液(pH8.3)，這樣便形成了凝膠孔徑和緩沖液pH值的不連續(xù)性。在濃縮膠中 HCl幾乎全部解離為Cl-，但只有極少部分甘氨酸解離為H2NCH2COO-。蛋白質(zhì)的等電點一般在pH5左右，在此條件下其解離度在HCl和甘氨酸之

5、間。當電泳系統(tǒng)通電后，這3種離子同向陽極移動。其有效泳動率依次為Cl-＞蛋白質(zhì)＞H2NCH2COO-，故C1-稱為快離子，而H2NCH2COO- 稱為慢離子。電泳開始后，快離子在前，在它后面形成離子濃度低的區(qū)域即低電導(dǎo)區(qū)。電導(dǎo)與電壓梯度成反比，所以低電導(dǎo)區(qū)有較高的電壓梯度。這種高電壓梯度使蛋白質(zhì)和慢離子在快離子后面加速移動。在快離子和慢離子之間形成—個穩(wěn)定而不斷向陽極移動的界面。由于蛋白質(zhì)的有效移動率恰好介于快慢離子之間，因此蛋白質(zhì)離子

6、就集聚在快慢離子之間被濃縮成—條狹窄帶。這種濃縮效應(yīng)可使蛋白質(zhì)濃縮數(shù)百倍。,電荷效應(yīng)：樣品進入分離膠后，慢離子甘氨酸全部解離為負離子，泳動速率加快，很快超過蛋白質(zhì)，高電壓梯度隨即消失。此時蛋白質(zhì)在均一的外加電場下泳動，但由于蛋白質(zhì)分子所帶的有效電荷不同，使得各種蛋白質(zhì)的泳動速率不同而形成一條條區(qū)帶。但在 SDS-PAGE電泳中，由于SDS這種陰離子表面活性劑以一定比例和蛋白質(zhì)結(jié)合成復(fù)合物，使蛋白質(zhì)分子帶負電荷，這種負電荷遠遠超過了蛋白質(zhì)

7、分子原有的電荷差別，從而降低或消除了蛋白質(zhì)天然電荷的差別；此外，由多亞基組成的蛋白質(zhì)和SDS結(jié)合后都解離成亞單位，這是因為SDS破壞了蛋白質(zhì)氫鍵、疏水鍵等非共價鍵。與SDS結(jié)合的蛋白質(zhì)的構(gòu)型也發(fā)生變化，在水溶液中SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物都具有相似的形狀，使得SDS-PAGE電泳的泳動率不再受蛋白質(zhì)原有電荷與形狀的影響。因此，各種SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物在電泳中不同的泳動率只反映了蛋白質(zhì)分子量的不同。,Acr-Bis,產(chǎn)品簡介：Ø 4

8、0% Acr-Bis(39:1)即為含40％ acrylamide-bisacrylamide的水溶液，其中acrylamide和bisacrylamide的比例為39:1。Ø 40% Acr-Bis(39:1)常用于配制各種PAGE凝膠，例如EMSA凝膠、RPA凝膠等，可以用于蛋白或核酸等的分離，是實驗室的常用 儲備液。保存條件： 4℃避光保存。注意事項：Ø 40% Acr-Bis(3

9、9:1)有一定毒性，使用時請注意適當防護。Ø 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。,聚丙烯酰胺凝膠電泳是以聚丙烯酰胺凝膠作為載體的一種區(qū)帶電泳。這種凝膠是以丙烯酰胺單體（Acrylamide，簡寫為Acr）和交聯(lián)劑N，N'-甲叉雙丙烯酰胺（N,N'-Methylena Bisacrylamide，簡寫為Bis）在催化劑的作用下聚合而成的。Acr和Bis在它們單獨存在或混合在一起時是穩(wěn)定的，且具