基于目標(biāo)捕獲和高通量測(cè)序檢測(cè)耐藥細(xì)菌的研究.pdf

1、目的:建立目標(biāo)捕獲和高通量測(cè)序相結(jié)合的方法，應(yīng)用于臨床耐藥細(xì)菌的檢測(cè)，達(dá)到同時(shí)獲得菌株鑒定結(jié)果、耐藥基因型及用于MLST分型的管家基因序列的目的，節(jié)約臨床診斷的時(shí)間，綜合分析本地區(qū)耐藥基因的分布情況，為臨床合理用藥和進(jìn)行流行病學(xué)監(jiān)測(cè)提供科學(xué)依據(jù)。
　　方法:參考相關(guān)文獻(xiàn)，選取大腸埃希菌常見(jiàn)的52種耐藥基因，Genbank上下載耐藥基因序列、大腸埃希菌16S rRNA基因序列及8個(gè)管家基因序列，序列交由美國(guó) Agilent公司設(shè)計(jì)合

2、成適配于高通量測(cè)序儀的Sureselect目標(biāo)捕獲試劑盒。對(duì)臨床收集的4株產(chǎn) ESBLs大腸埃希菌進(jìn)行檢測(cè)，建立目標(biāo)捕獲-高通量測(cè)序方法，并驗(yàn)證該方法的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。應(yīng)用目標(biāo)捕獲-高通量測(cè)序方法檢測(cè)臨床收集的22株產(chǎn) ESBLs大腸埃希菌，檢測(cè)結(jié)果經(jīng) BLAST比對(duì)，獲得檢測(cè)菌株的耐藥基因型，結(jié)合藥敏試驗(yàn)結(jié)果分析本地區(qū)大腸埃希菌的耐藥特點(diǎn)；獲得管家基因序列，使用 Pasture軟件進(jìn)行 MLST分型，分析菌株之間的流行病學(xué)關(guān)系。

3、r>　　結(jié)果:
　?。?）運(yùn)用我們建立的目標(biāo)捕獲-高通量測(cè)序方法檢測(cè)臨床收集的4株產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌，得到的16S rRNA基因序列經(jīng) BLAST比對(duì)后證實(shí)為大腸埃希菌，與 VITEK-2檢測(cè)系統(tǒng)鑒定結(jié)果相一致。選取部分耐藥基因采用 PCR-Sanger測(cè)序，兩者測(cè)序結(jié)果完全一致。運(yùn)用該方法重復(fù)檢測(cè)這4株菌株，兩次得到的結(jié)果一致。
　　（2）臨床收集產(chǎn) ESBLs大腸埃希菌22株，運(yùn)用所建立的目標(biāo)捕獲-高通量測(cè)序方法進(jìn)行

4、檢測(cè)，得到的16S rRNA基因序列經(jīng) BLAST比對(duì)后證實(shí)所有菌株為大腸埃希菌，與 VITEK-2檢測(cè)系統(tǒng)鑒定結(jié)果相一致。
　?。?）得到的耐藥基因序列經(jīng) BLAST比對(duì)，共得到24種耐藥基因型。有20株檢出8種 ESBLs基因，其中 CTX-M-14、CTX-M-55、CTX-M-15、CTX-M-27、CTX-M-65、SHV-12、OXA-1、OXA-10型的檢出率分別為68.18％、45.45%、13.64%、4.55%

5、、9.09%、18.18%、4.55%和4.55%。有3株檢出 AmpC類耐藥基因，均為 DHA-1型。有20株檢出6種氨基糖苷類藥物耐藥基因，其中 aac(3)-II、aac(6’)-Ib、ant(3’’)-I、aph(3’)-I、aadA、rmtB型的檢出率分別為63.63%、18.18%、13.64%、9.09%、31.82%和4.55%。有17株檢出6種喹諾酮類藥物耐藥基因，其中 gyrA、gyrB、qnrB、qnrS、aac(

6、6’)-Ib-cr、qepA型的檢出率分別為45.45%、4.55%、4.55%、9.09%、36.36%和22.73%。有18株檢出2種四環(huán)素類耐藥基因，其中 tet(A)和tet(B)型的檢出率分別為68.18%、45.45%。TEM-1型基因檢出率為90.91%，其他耐藥基因均未檢出。所有菌株均檢出三種及以上不同種類藥物耐藥基因。藥敏結(jié)果顯示所有菌株對(duì)第三代頭孢菌素類藥物耐藥嚴(yán)重，多重耐藥株在50%以上。
　?。?）得到的管

7、家基因序列使用 Pasture軟件進(jìn)行 MLST分型，共得到16種不同的ST型，檢出率最高的是 ST38型，共檢出3株，其他還有 ST131型、ST405型等。
　　結(jié)論:
　?。?）成功構(gòu)建了可同時(shí)完成菌株鑒定、耐藥基因檢測(cè)及流行病學(xué)分型的目標(biāo)捕獲-高通量測(cè)序方法，證明了該方法有很好的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性，初步證實(shí)該方法可應(yīng)用于臨床耐藥菌的檢測(cè)，給臨床快速診斷和用藥提供一定的科學(xué)依據(jù)。
　?。?）產(chǎn) ESBLs大腸埃希菌

8、耐藥情況嚴(yán)峻，耐藥基因檢出率高。與β-內(nèi)酰胺類相關(guān)的耐藥基因主要為 TEM-1型和CTX-M-14型，與氨基糖苷類藥物耐藥相關(guān)的主要為 aac(3)-II型和aadA型，與喹諾酮類藥物耐藥相關(guān)的主要為 gyrA型與aac(6’)-Ib-cr型，與四環(huán)素類藥物耐藥相關(guān)的主要為 tet(A)型和tet(B)型。
　?。?）本研究中產(chǎn) ESBLs大腸埃希菌遺傳背景具有多樣性，ST38型為主要流行ST型，ICU內(nèi)有交叉感染的可能，需加強(qiáng)監(jiān)