高通量測序技術(shù)及其在腫瘤研究中的應(yīng)用

1、高通量測序技術(shù)及其在腫瘤研究中的應(yīng)用,匯報人：,目錄,一、背景介紹,高通量測序技術(shù)（High-throughput sequencing）又稱“下一代”測序技術(shù)（“Next-generation” sequencing technology），以能一次并行對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測定和一般讀長較短等為標(biāo)志。高通量測序技術(shù)是對傳統(tǒng)測序一次革命性的改變，一次對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測定，因此在有些文獻中稱其為下一代

2、測序技術(shù)(next generation sequencing)足見其劃時代的改變，同時高通量測序使得對一個物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進行細致全貌的分析成為可能，所以又被稱為深度測序(deepsequencing)。,什么是高通量測序?,2005年開始,20世紀(jì)80年代中期,正在研發(fā),測序的發(fā)展歷程,,,,目前常說的高通量測序是指用第二代測序技術(shù)來進行測序，第三代測序技術(shù)還不是很成熟，有的剛剛出現(xiàn)，有的則正在研制,第二代主要的測序平臺,主要的

3、測序平臺,數(shù)據(jù)分析,樣品的制備,,,文庫的構(gòu)建,二、測序流程,測序的流程,上機測序,Description of the company’s productsDescription of the company’s businessDescription of the company’s technologyDescription of the company’s contents,1. 對測序后生成的數(shù)據(jù)進行分析2.

4、普通的分析：去除低質(zhì)量數(shù)據(jù)，進行序列組裝，評估測序質(zhì)量等3. 高級分析：對基因進行注釋，分析表達情況、構(gòu)建互做網(wǎng)絡(luò)等,1. 在第二代測序儀上進行測序，設(shè)定程序,1. DNA序列打斷、RNA序列要反轉(zhuǎn)錄為DNA序列再打斷（超聲破碎）200-300bp2. 加接頭，電泳選擇片段大小3. PCR擴增，轉(zhuǎn)到Flowcell上4. 文庫質(zhì)檢（QPCR),1. 組織樣品的培養(yǎng)或病理樣品的收集2. 樣品總DAN、RNA的提取3

5、. 質(zhì)檢（總量、純度、完整性、有沒有降解等）,,,三、對腫瘤研究的方法,,,,,,DNA方向,1.實體腫瘤基因組學(xué)研究,一.研究目的和意義 尋找適用于腫瘤早期診斷、腫瘤分型、病程發(fā)展（惡化和轉(zhuǎn)移）和預(yù)后的基因組分子標(biāo)記，篩選藥物的靶標(biāo)。二.研究對象 實體腫瘤的鑒別，按照臨床病理分類，例如：肺癌、胃癌、肝癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、宮頸癌、胰腺癌、膀胱癌、食道癌、腎癌等。三.測序方案 Exome capture seq（外

6、顯組捕獲測序）描繪基因組外顯子區(qū)域的SNV（單核苷酸變異），Indel（插入缺失）、CNV（拷貝數(shù)變異），分析基因變異和癌癥的相關(guān)性。 Target capture seq（目標(biāo)捕獲測序）對一些功能富集的基因或研究人員感興趣的基因組的部分區(qū)域進行捕獲，分析基因變異對癌癥的影響。例如：癌癥相關(guān)基因（508個）、免疫（883個）、凋亡（1536個）、細胞周期（1005個）、p53通路（162個）等。 Whole genome

7、 seq （全基因組測序）對基因組上所有的基因進行測序分析，找到大量的SNV、CNV、Indel、SV（結(jié)構(gòu)變異）等基因變異信息，更為全面的解析癌癥發(fā)生發(fā)展的分子機制。四.案例解析1.外顯組測序鑒定體細胞突變2.外顯組測序分析拷貝數(shù)和基因融合3.全基因組重測序展示人類首個癌基因組圖譜4.全基因組測序解析基因組拷貝數(shù)變異,,,DNA方向,2.血液腫瘤基因組學(xué)研究,一.研究目的和意義 尋找適用于白血病早期診斷、疾病分期或分級

8、、預(yù)后的分子標(biāo)記，藥物篩選的靶標(biāo)，指導(dǎo)個體化用藥的分子依據(jù)。二.研究對象 血液病類型：骨髓增生異常綜合癥（MDS），多發(fā)性骨髓瘤，非霍奇金淋巴瘤，霍奇金淋巴瘤，慢性淋巴細胞白血病，慢性髓細胞白血病，急性淋巴細胞白血病，急性髓細胞白血?。毙粤＜毎籽。Ｈ?測序方案 Exome capture seq（外顯組捕獲測序）描繪基因組外顯子區(qū)域的SNV（單核苷酸變異），Indel（插入缺失）、CNV（拷貝數(shù)變異），分析

9、基因變異和癌癥的相關(guān)性。 Target capture seq（目標(biāo)捕獲測序）對一些功能富集的基因或研究人員感興趣的基因組的部分區(qū)域進行捕獲，分析基因變異對癌癥的影響。例如：癌癥相關(guān)基因（508個）、免疫（883個）、凋亡（1536個）、細胞周期（1005個）、p53通路（162個）等。 Whole genome seq （全基因組測序）對基因組上所有的基因進行測序分析，找到大量的SNV、CNV、Indel、SV（結(jié)構(gòu)變

10、異）等基因變異信息，更為全面的解析癌癥發(fā)生發(fā)展的分子機制。四.案例解析1.對4個慢性淋巴細胞性白血?。–LL）進行全基因組測序分析，在染色體13q14上有3位患者出現(xiàn)了基因組大片段的缺失。2.研究者選取22個FLT3-ITD突變陽性患者及29個FLT3-ITD 陰性患者進行目標(biāo)區(qū)域捕獲測序研究，能夠檢測到FLT3不同位置的ITD，并在FLT3-ITD陰性患者基因組上發(fā)現(xiàn)了比較低頻的ITD，為白血病的分子診斷提供了更為準(zhǔn)確的信息。

11、,,,DNA方向,3.表觀遺傳學(xué)研究,一.研究目的和意義 DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)研究的重點，是基因調(diào)控的手段之一，在維持細胞正常功能、傳遞基因組印記、胚胎發(fā)育和腫瘤發(fā)生等方面起著至關(guān)重要的作用。檢測表觀遺傳學(xué)變異尤其是基因組的甲基化，探討甲基化對于生物學(xué)功能的影響，并篩選可應(yīng)用作為疾病早期診斷、分級和分型的分子標(biāo)記。二.研究對象 研究對象：各類腫瘤、發(fā)育、干細胞分化的不同階段。三.測序方案 RRBS（Reduced

12、 Representation Bisulfite Sequencing）基于Msp|酶切消化和bisulfite處理的高性價比方法，可對基因組promoter區(qū)及CpG島區(qū)域的DNA甲基化狀態(tài)進行樣品之間的比較分析。 MBD-Seq（Methylated DNA Binding Domain Sequencing）由于在哺乳動物中甲基化一般發(fā)生在CpG的胞嘧啶5位碳原子上，所以可通過特異性結(jié)合甲基化DNA的蛋白MBD2b

13、富集高甲基化的DNA片段，并結(jié)合第二代高通量測序，對富集到的DNA片段進行測序，從而檢測全基因組范圍內(nèi)的甲基化位點。 MeDIP-Seq（Methylated DNA Immunoprecipitation Sequencing ）通過使用5' -甲基胞嘧啶抗體富集高甲基化的DNA片段，然后將富集后的DNA進行高通量測序。 BS（Bisulfite Sequsencing）Bisulfite處理能夠?qū)⒒蚪M中未甲基

14、化的C堿基與甲基化的C堿基區(qū)分開來，因此成為表觀遺傳學(xué)研究的經(jīng)典實驗方法。將Bisulfite處理與高通量測序技術(shù)的結(jié)合的Bisulfite Sequencing能夠繪制單堿基分辨率的DNA甲基化圖譜，可用于研究特定DNA區(qū)域甲基化與特定表型之間的關(guān)聯(lián)。,,,DNA方向,4.免疫組學(xué)研究,一.研究的背景 T細胞受體（T cell receptor，TCR）是T細胞表面特異性識別抗原和介導(dǎo)免疫應(yīng)答的分子，是人類基因組中多態(tài)性最高的區(qū)

15、域之一，決定著人的免疫系統(tǒng)如何適應(yīng)環(huán)境的變化。T細胞受體庫的多樣性（包括基因重組以及選擇性表達）直接反映了機體免疫應(yīng)答的狀態(tài)。二.適用范圍 腫瘤免疫、自身免疫性疾病、器官移植免疫監(jiān)測、疫苗注射免監(jiān)測三.案例解析目的 ： 目的：干細胞移植（HSCT）后，通過對TCR（T細胞受體）的CDR3（VDJ基因重組區(qū)域）區(qū)域進行重組分析獲得移植后病人的CD4+和CD8+T細胞的多樣性，從而檢測移植受體免疫重建的結(jié)果。通過比較不同

16、來源的干細胞（造血干細胞、去除T細胞的造血干細胞、臍血干細胞）移植后的TCR的多樣性進行移植效果的判斷，并闡述TCR多樣性與細菌感染的關(guān)系。 方法：選取干細胞移植的病人作為研究對象，時間點為移植后6個月和12個月，以健康人作為對照。從8ml外周血中分理CD4+和CD8+T細胞處利用高通量測序技術(shù)結(jié)合生物信息學(xué)分析檢測TCR的CDR3區(qū)域重組的多樣性。結(jié)果：1.對去除T細胞（TCD）的干細胞移植病人的測序結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)移植病人的TC

17、R的多樣性比健康人要低。 2. 對不同來源的干細胞進行TCR多樣性分析，發(fā)現(xiàn)臍血干細胞移植后，TCR的多樣性最高，且CD4+來源的TCR比CD8+來源的TCR多樣性高。 3.年齡和供體對干細胞移植后TCR的多樣性影響不大，但是出現(xiàn)急性移植物抗宿主病及全身類固醇治療的病人有著較高的TCR多樣性，相反，出現(xiàn)巨細胞病毒（CMV）皰疹病毒（EBV）感染的病人TCR多樣性比較低。,,,RNA方向,1.實體腫瘤轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究,

18、一.研究目的和意義 尋找適用于腫瘤早期診斷、腫瘤分型（在分子水平對疾病能夠準(zhǔn)確分型）、病程發(fā)展（惡化和轉(zhuǎn)移）和預(yù)后的轉(zhuǎn)錄組分子標(biāo)記，篩選藥物的靶標(biāo)，用藥的分子依據(jù)。二.研究對象 實體腫瘤的鑒別，按照臨床病理分類，例如：肺癌、胃癌、肝癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、宮頸癌、胰腺癌、膀胱癌、食管癌、鼻咽癌、腎癌、淋巴瘤等。三.測序方案 RNA-seq（PolyA法mRNA測序）發(fā)現(xiàn)癌癥發(fā)生或轉(zhuǎn)移相關(guān)的mRNA的變異（幾乎所有基因的表

19、達量差異、基因融合和選擇性剪切等事件）。 SmallRNA-seq（小RNA測序）分析miRNA的表達量差異，預(yù)測miRNA作用的靶基因，篩選可用于疾病診斷和預(yù)后的分子標(biāo)記。 lncRNA-seq（長鏈非編碼RNA測序）通過PolyA尾抓取或核糖體RNA去除的方法，富集mRNA和lncRNA，可以發(fā)現(xiàn)樣品中的新lncRNA，并同時檢測樣本中的mRNA和lncRNA，進行共表達分析，以mRNA的功能富集分析挖掘lncR

20、NA的功能和潛在作用機制，探討lncRNA和疾病的關(guān)系。四.案例解析,,,RNA方向,2.血液腫瘤轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究,一.研究目的和意義 尋找適用于白血病早期診斷、疾病分期或分級、預(yù)后的分子標(biāo)記，藥物篩選的靶標(biāo)，指導(dǎo)個體化用藥的分子依據(jù)。二.研究對象 血液病類型：骨髓增生異常綜合癥（MDS），多發(fā)性骨髓瘤，非霍奇金淋巴瘤，霍奇金淋巴瘤，慢性淋巴細胞白血病，慢性髓細胞白血病，急性淋巴細胞白血病，急性髓細胞白血?。毙粤＜毎籽?/p>

21、）。三.測序方案 RNA-seq（PolyA法mRNA測序）發(fā)現(xiàn)癌癥發(fā)生或轉(zhuǎn)移相關(guān)的mRNA的變異（幾乎所有基因的表達量差異、基因融合和選擇性剪切等事件）。 SmallRNA-seq（小RNA測序）分析miRNA的表達量差異，預(yù)測miRNA作用的靶基因，篩選可用于疾病診斷和預(yù)后的分子標(biāo)記。 lncRNA-seq（長鏈非編碼RNA測序）通過PolyA尾抓取或核糖體RNA去除的方法，富集mRNA和lncRNA，可

22、以發(fā)現(xiàn)樣品中的新lncRNA，并同時檢測樣本中的mRNA和lncRNA，進行共表達分析，以mRNA的功能富集分析挖掘lncRNA的功能和潛在作用機制，探討lncRNA和疾病的關(guān)系。四.案例解析,,,RNA方向,3.Exosome研究腫瘤細胞通訊、擴散機制,一.研究背景 Exosome來源于晚期核內(nèi)體(也稱為多囊泡體)的囊泡，是由活細胞分泌的而來，是一類大小介于30-100nm的含有RNA和蛋白質(zhì)的微囊，幾乎所有類型的細胞都能

23、分泌，廣泛存在于各種體液中。Exosome參與調(diào)控重要的細胞生理活動，在免疫應(yīng)答、凋亡、血管生成、炎癥反應(yīng)、凝結(jié)過程中的作用均有報道，可以成為多種疾病的早期診斷標(biāo)記物，也能作為靶向藥物的載體進行疾病治療。 2013年10月7號，蘭迪.謝克曼等三位科學(xué)家獲得2013年諾貝爾醫(yī)學(xué)獎，他們發(fā)現(xiàn)細胞中囊泡像船隊一樣運送貨物至精準(zhǔn)目的地的作用方式，這對大腦溝通方式、激素釋放和免疫系統(tǒng)至關(guān)重要。二.Exosome成分 蛋白質(zhì)：如微管蛋白

24、、肌動蛋白、肌動蛋白結(jié)合蛋白、熱休克蛋白、三聚體Ｇ蛋白、膜蛋白如：四跨膜蛋白（CD9，CD63，CD81，CD82）、整合素、膜聯(lián)蛋白等。RNA：大量的rRNA, miRNA，極微量lncRNA, mRNA, snRNA, piRNA等。脂質(zhì)：磷脂酰膽堿、膽固醇、神經(jīng)鞘磷脂、神經(jīng)節(jié)苷脂、磷脂酰乙醇胺等。三Exosome small RNA研究思路 差異miRNA篩選(新一代測序：Small RNA測序)->生物信息分析