乳液PCR及其在高通量檢測中的應(yīng)用研究.pdf

1、乳液PCR是利用油包水乳液體系中的微液滴作為反應(yīng)器進行PCR擴增。近年來乳液PCR在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用越來越廣，特別是在新一代DNA測序技術(shù)興起以來，乳液PCR更是以其獨特的優(yōu)勢在高通量測序模板制備中占據(jù)重要的地位。目前飛速發(fā)展的高通量DNA測序技術(shù)的更高的目標(biāo)和要求也推動了乳液PCR等的進一步發(fā)展與完善。為此論文以本實驗室擁有的SOLiD高通量測序平臺為基礎(chǔ)，對基于乳液PCR的單分子多拷貝測序模板制備過程進行了全面的優(yōu)化改良；同時還對

2、測序模板制備過程中乳液PCR的副產(chǎn)物進行了回收利用，在多基因位點的并行檢測中得到了很好的應(yīng)用。本論文的主要研究內(nèi)容如下：
　　1.基于乳液PCR的測序模板制備的優(yōu)化。首先進行了乳液體系穩(wěn)定性的研究，在對幾種乳液油相配置方案進行了比較后獲得了一種更加穩(wěn)定的可以用于測序模板制備的乳液體系，該方案制備的乳液體系熱穩(wěn)定性好，微球在液滴中的分布均勻，單克隆比例較高；隨后進行了乳液體系中的水相成分(微球及擴增酶等)的全面本地化研究，建立了一套

3、可以高效進行測序模板制備的乳液PCR體系與有效擴增微球富集的技術(shù)平臺。
　　2.在基于微球的乳液PCR為高通量測序模板的制備過程中，除微球以外的擴增產(chǎn)物及微球清洗后變性洗脫下來的單鏈DNA產(chǎn)物均被丟棄，本研究對該通常被丟棄的乳液PCR產(chǎn)物進行回收利用研究。結(jié)合熒光標(biāo)記與DNA微陣列技術(shù)，利用乳液PCR對細(xì)菌和真菌代謝產(chǎn)生的13種毒素相關(guān)基因進行了并行檢測實驗，論文在個別樣本中檢測到了玉米烯酮毒素的兩種相關(guān)基因位點序列，為相關(guān)食品中