全基因組拷貝數(shù)變異檢測(cè)在產(chǎn)前高通量測(cè)序異常信號(hào)分析中的應(yīng)用研究.pdf

1、研究背景：
　　隨著細(xì)胞遺傳學(xué)及分子遺傳學(xué)的發(fā)展，產(chǎn)前篩查和產(chǎn)前診斷的技術(shù)及方法也呈多元化發(fā)展，目前國(guó)內(nèi)常用的中孕期母血清學(xué)產(chǎn)前篩查，可以對(duì)發(fā)病率較高的13、18、21-三體及神經(jīng)管畸形的胎兒進(jìn)行篩查。此外，早孕期母血清學(xué)篩查、早孕期胎兒NT值等超聲指標(biāo)篩查、早中孕期母血清學(xué)聯(lián)合篩查等方案，有的地區(qū)也有開(kāi)展。但無(wú)論以上哪種篩查方式，對(duì)胎兒非整倍體的篩查效率都偏低，假陽(yáng)性率較高。上述篩查高風(fēng)險(xiǎn)的孕婦，可于早、中或晚孕期通過(guò)采集胎兒細(xì)

2、胞、組織等樣本來(lái)進(jìn)行胎兒遺傳物質(zhì)的檢測(cè)，經(jīng)早孕期絨毛穿刺活檢、中孕期羊膜腔穿刺、中晚孕期胎兒臍帶穿刺或個(gè)別嚴(yán)重畸形兒的心臟穿刺等有創(chuàng)手術(shù)操作來(lái)獲取胎兒細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，其準(zhǔn)確性較高，但從安全性上來(lái)講，有創(chuàng)的產(chǎn)前診斷方式不適合作為一種大范圍的篩查手段，臨床上迫切需要篩查效率更高的篩查技術(shù)方法。
　　有研究表明基因組拷貝數(shù)變異(Copy Number Variations，CNVs)在某些人類(lèi)疾病中扮演著重要角色。一些染色體微重復(fù)微缺失綜

3、合征，如:Williams-Beuren綜合征、Angelman/Prader-Willi綜合征、Charcot-Marie-Tooth綜合征等，均是由CNVs或染色體片段的缺失或重復(fù)導(dǎo)致[1-3]。如單核苷酸多態(tài)性一樣，多數(shù)CNVs以正常多態(tài)形式存在，只有少數(shù)的CNVs與疾病相關(guān)。染色體微陣列分析(Chromosomal Microarray AnalysisCMA)即:比較基因組雜交微陣列和單核苷酸多態(tài)微陣列的出現(xiàn)，大大的提高了人類(lèi)

4、基因組CNVs的發(fā)現(xiàn)。因其高通量、高分辨率、無(wú)需培養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)，染色體微陣列技術(shù)在產(chǎn)前診斷領(lǐng)域中的應(yīng)用價(jià)值逐漸得到認(rèn)可。
　　近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)孕婦外周血血漿游離DNA中含有一定比例的胎兒游離DNA，其DNA片段長(zhǎng)度較小，絕對(duì)含量隨著孕周的增長(zhǎng)而增加，且可在分娩后快速降解消失，為提取和檢測(cè)孕婦血漿游離DNA作為獲取胎兒遺傳信息的無(wú)創(chuàng)檢測(cè)技術(shù)提供了可能[1-4]。
　　新一代高通量測(cè)序技術(shù)是可以同時(shí)進(jìn)行數(shù)百萬(wàn)個(gè)核苷酸單分子序列測(cè)序分

5、析的技術(shù)，其基本原理是:首先將基因組DNA片段化，隨后加入測(cè)序的接頭和引物，簇生成后進(jìn)行橋式擴(kuò)增，將片段連接到flowcell上，每個(gè)反應(yīng)進(jìn)行時(shí)均加入一個(gè)可逆終止的脫氧核苷酸，進(jìn)行熒光掃描。這種高通量，高精確度的測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)，在孕婦血漿中具有相對(duì)穩(wěn)定比例的游離胎兒DNA的基礎(chǔ)上，大大推動(dòng)了無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)(Noninvasive Prenatal Testing，NIPT)技術(shù)的應(yīng)用。
　　染色體的非整倍體是臨床上最常見(jiàn)的染色體異常

6、，且多數(shù)是重大致殘致愚性遺傳病。母血漿中游離胎兒DNA的發(fā)現(xiàn)及在此基礎(chǔ)上高通量測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用，開(kāi)創(chuàng)了胎兒染色體非整倍體等遺傳病的無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)的新紀(jì)元。世界各地多個(gè)研究小組對(duì)該方法進(jìn)行的大量臨床研究表明，目前該技術(shù)針對(duì)最常見(jiàn)的21-三體的無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)的靈敏度和特異性均已達(dá)到99％以上。最新研究已證實(shí)可以從孕婦血漿游離DNA中拼接出胎兒和孕婦的全基因組信息，為以孕婦血漿游離DNA為研究材料進(jìn)行胎兒CNVs甚至單基因病的檢測(cè)提供了研究基礎(chǔ)[5

7、-8]。
　　目的：
　　針對(duì)臨床上具有NIPT指征的高危孕婦，應(yīng)用新一代高通量測(cè)序技術(shù)進(jìn)行產(chǎn)前檢測(cè)，搜集、整理NIPT檢測(cè)過(guò)程中出現(xiàn)的各種染色體非整倍體異常信號(hào)以及CNVs相關(guān)異常信號(hào)病例，利用有創(chuàng)產(chǎn)前診斷技術(shù)獲取胎兒細(xì)胞后，采用染色體微陣列分析技術(shù)進(jìn)行檢驗(yàn)、驗(yàn)證，分析NIPT在染色體數(shù)目異常和致病性CNVs檢測(cè)中的準(zhǔn)確性，以判斷NIPT的臨床應(yīng)用價(jià)值、明確致病性CNVs的診斷并提供臨床咨詢(xún)，同時(shí)也可為CNVs數(shù)據(jù)庫(kù)提供新

8、的科研數(shù)據(jù)。
　　方法：
　　門(mén)診具有NIPT指征的孕婦常規(guī)進(jìn)行知情告知，經(jīng)高通量測(cè)序和數(shù)據(jù)分析后，以NIPT篩查結(jié)果提示胎兒13、18、21、性染色體非整倍體高風(fēng)險(xiǎn)以及提示胎兒CNVs異常信號(hào)的孕婦為研究對(duì)象。知情同意后行有創(chuàng)產(chǎn)前診斷，根據(jù)孕周需要獲取胎兒羊水或臍血等標(biāo)本分別進(jìn)行胎兒染色體微陣列芯片分析。若經(jīng)有創(chuàng)產(chǎn)前診斷驗(yàn)證胎兒為13、18、21或性染色體非整倍體，對(duì)孕婦夫婦進(jìn)行遺傳咨詢(xún);若經(jīng)有創(chuàng)產(chǎn)前診斷驗(yàn)證胎兒確實(shí)存在異

9、常CNVs，進(jìn)一步復(fù)查胎兒父母的外周血染色體微陣列芯片，以明確此CNVs的遺傳來(lái)源，并根據(jù)最終的染色體微陣列芯片結(jié)果進(jìn)行遺傳咨詢(xún)。
　　結(jié)果：
　　對(duì)臨床上有適應(yīng)癥的孕婦外周血樣本進(jìn)行胎兒染色體非整倍體NIPT篩查，共篩出21-三體高風(fēng)險(xiǎn)16例、18-三體高風(fēng)險(xiǎn)3例，經(jīng)有創(chuàng)產(chǎn)前診斷進(jìn)行胎兒染色體核型和染色體微陣列檢驗(yàn)、驗(yàn)證后，確認(rèn)其中21三體兒15例、18三體兒3例;其中1例NIPT篩查為21-三體高風(fēng)險(xiǎn)的胎兒，臍血染色體核

10、型和臍血CMA檢測(cè)結(jié)果均為46，XX，產(chǎn)前診斷證實(shí)該例為21三體假陽(yáng)性，出生后隨訪(fǎng)正常。
　　共篩查提示性染色體非整倍體病例9例，經(jīng)有創(chuàng)產(chǎn)前診斷確認(rèn)了其中5例存在性染色體非整倍體，分別為47，XXX2例，47，XXY1例，47，XYY1例，47，XYY/46，XY嵌合體1例，其余4例未檢出性染色體異常，為假陽(yáng)性。
　　此外，NIPT提示13號(hào)染色體微缺失病例1例，18號(hào)染色體微重復(fù)病例1例，18號(hào)染色體部分缺失病例1例，染色