肺炎克雷伯菌質(zhì)?；蚪M的高通量測序和遺傳變異分析.pdf

1、研究目的： 1.分離、鑒定和純化臨床來源的多重耐藥肺炎克雷伯菌206株(2002年-2008年間)，確定其耐藥譜和質(zhì)粒譜； 2.獲得1株代表性多重耐藥肺炎克雷伯菌的質(zhì)粒全序列，并結(jié)合生物信息學(xué)工具確定質(zhì)粒全序列編碼的基因，并預(yù)測各編碼基因的功能； 3.Solexa高通量測序所有206株多重耐藥肺炎克雷伯菌的全部質(zhì)?；蚪MDNA，獲得大規(guī)模短序列； 4.將Solexa高通量測序獲得的短序列和代表性多重耐藥肺

2、炎克雷伯菌的質(zhì)粒全序列進(jìn)行比對定位，揭示多重耐藥肺炎克雷伯菌質(zhì)粒DNA的遺傳變異和分子進(jìn)化機制。 方法： 1、收集臨床來源的多重耐藥肺炎克雷伯菌，測定耐藥譜和耐藥程度(MIC)，堿裂解法提取肺炎克雷伯菌質(zhì)粒DNA； 2、構(gòu)建插入大小為2-3Kb的pUC18文庫和35-40Kb的Fosmid文庫，采用傳統(tǒng)Sanger法測序，利用Phred/Phrap/Consed軟件進(jìn)行序列拼接，根據(jù)pUC18和Fosmid文庫克

3、隆末端關(guān)系及PCR反應(yīng)，完成contig之間的連接； 3、提取所有206株多重耐藥肺炎克雷伯菌的全部質(zhì)粒DNA，Solexa高通量測序獲得大規(guī)模的短序列。根據(jù)菌株來源的年代，將所有高通量測序的多重耐藥肺炎克雷伯菌質(zhì)?；蚪M分為兩個不同的部分；第一部分包含110株菌株(S1)，采集時間為2002-2006，第二部分包含96株菌株(S2)，采集時間是2007-2008； 4、采用Solexa Genome Analysis

4、System和MAQ軟件包，將高通量測序獲得的短序列比對定位到參照質(zhì)粒全序列上； 5、采用比較基因基因組學(xué)和分子進(jìn)化方法分析揭示多重耐藥肺炎克雷伯菌質(zhì)粒DNA的遺傳變異和分子進(jìn)化機制。 結(jié)果： 1.第一批數(shù)據(jù)中包含110株多重耐藥肺炎克雷伯菌(S1)的Solexa reads總數(shù)為8，862，022，其中可以定位到3個參照質(zhì)?；蚪M上的序列約占30％。第二批數(shù)據(jù)包含96株多重耐藥肺炎克雷伯菌(S2)的solexa

5、 reads總數(shù)為8，141，863，其中29％的reads可以定位到參照質(zhì)?；蚪M上； 2.對兩批數(shù)據(jù)的定位結(jié)果分析得知，兩批樣品中pKF3-94質(zhì)粒的覆蓋度都約為500倍，而對于其余兩個質(zhì)粒pKF3-70和pKF3-140則差異較大，在第二批樣品中存在明顯的質(zhì)粒丟失。 3.分析兩批不同數(shù)據(jù)中相同SNPs的分布頻率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)pKF3-94在兩批不同數(shù)據(jù)中，SNPs分布頻率基本相同，而pKF3-70和pKF3-140則相

6、差非常大。 4.分析找到的SNPs，發(fā)現(xiàn)這些SNPs中的一大部分都位于編碼區(qū)(83.4％in S1，83.5％in S2)，其中一大部分又是非同義替換(27.1％of total SNPs in S1和24.7％of total SNPs in S2) 5.有意思的是，發(fā)現(xiàn)這些非同義替換的SNPs主要位于耐藥基因、質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移相關(guān)基因、質(zhì)粒復(fù)制和分化相關(guān)基因。 6.在測序獲得的Solexa短序列中，意外地發(fā)現(xiàn)存在

7、很多的共進(jìn)化的非同義替換SNPs位點，并且這些主要都位于質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移相關(guān)基因。 結(jié)論： 1.在方法學(xué)上，首次表明新一代高通量測序技術(shù)非常適合用來分析多重耐藥細(xì)菌的質(zhì)粒基因組的遺傳變異規(guī)律。同時，對于大小為100K左右的質(zhì)粒基因組，一個lane的Solexa短序列數(shù)據(jù)已經(jīng)足夠可以檢測不同質(zhì)?；蚪M的SNPs位點 2.除了檢測SNPs位點以外，揭示了肺炎克雷伯菌質(zhì)?；蚪M的一個動態(tài)過程，表明不同的肺炎克雷伯菌質(zhì)粒基因

8、組存在大量的基因復(fù)制，基因丟失和水平基因轉(zhuǎn)移情況。 3.發(fā)現(xiàn)外排泵相關(guān)基因(e.g.tetracycline efflux pump，ABC transporter)、耐藥相關(guān)基因(e.g.beta-lactamase，macrolide phosphotransferase，streptomycin adenylyltransferase， aminoglycoside acetyltransferase， aminoglyc

9、oside phosphotransferase)在2部分不同的肺炎克雷伯菌質(zhì)?；蚪MSolexa短序列中存在顯著差異，而造成這一結(jié)果的原因可能是第二部分肺炎克雷伯菌耐藥程度的增加。 4.系統(tǒng)分析了206株肺炎克雷伯菌質(zhì)?；蚪M的SNPs位點，發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移相關(guān)基因和耐藥基因(e.g.beta lactamase，tetracycline efflux protein，and aminoglycoside resistance