多重耐藥肺炎克雷伯菌可移動基因組的研究.pdf

1、微生物能夠通過基因水平轉移的方式獲得致病和耐藥等相關基因。質粒、插入序列（insertion sequence，IS）、轉座子、整合子、整合性接合元件（integrative and conjugative element，ICE）和其它基因組島等可移動遺傳元件是推動這一過程的關鍵遺傳介質，這些可移動遺傳元件組成了可移動基因組（mobile genome，mobilome）。
　　肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumon

2、iae）為條件致病菌，目前因引發(fā)嚴重耐藥問題引起廣泛的重視。肺炎克雷伯菌 HS11286是2011年從上海某醫(yī)院臨床樣本中分離得到的耐碳青霉烯類抗生素的菌株，屬于ST11型，全基因組已完整測定。本文對其可移動基因組進行了識別和研究，包括6個質粒、49個插入序列、9個轉座子、1個Class I整合子、2個ICE和7個前噬菌體。IS、轉座子和整合子多位于質粒上。而HS11286攜帶超過20個預測的耐藥基因，其中17個也位于質粒上，包括碳青霉

3、烯類抗生素抗性基因 blaKPC-2。遺傳背景分析表明轉座子 Tn3、Tn1721、Tn5393，整合子ΔIn2和插入序列ISCR3、ISCR2對耐藥基因的獲得有重要貢獻。其它插入元件對耐藥遺傳背景進化有重要作用，其中IS26是一個高度活躍的、推動該進化進程的插入序列。進而，利用λred重組和Flp-FRT重組突變方法對blaKPC-2和一段26 kb含有13個耐藥基因的區(qū)域進行敲除。抗菌藥物敏感性試驗表明，缺失突變株對臨床常用抗菌藥物

4、的敏感性大幅提高，與突變后基因型相符，至此也成功構建了可用于安全遺傳操作的模式菌株。此外，對HS11286的ICE進行了研究。其中，ICEKpnHS11286-1帶有一個已知的毒力島；而ICEKpnHS11286-2功能未知。本研究開發(fā)了一種利用sacB反選擇的ICE敲除策略，通過篩選自然丟失該元件的方法獲得目標突變株。應用該方法成功獲得ICEKpnHS11286-1缺失的突變株。但發(fā)現(xiàn)該突變株在染色體上發(fā)生了非預期突變。結合序列分析和

5、實驗方法對突變進行了準確定位，確定這種非預期突變是一種染色體重組現(xiàn)象，與ICEKpnHS11286-1重組位點的序列相同，可能是由該ICE整合酶介導的，但相關機制有待于研究。
　　ICE是一種廣泛存在于細菌中的可自主移動元件，自身編碼重組和接合轉移所需的全部功能，攜帶多樣化附屬功能基因，是耐藥和致病基因播散的一種有效介質，目前尚缺乏系統(tǒng)研究。我們通過文獻挖掘方式和生物信息學方法收集了428個ICE，并進行分類。ICE在DNA水平呈

6、現(xiàn)多樣性，但在ICE家族內進行蛋白序列比較發(fā)現(xiàn)同一家族ICE擁有保守骨架和可變區(qū)域。通過基于隱馬爾科夫模型特征譜（profile hidden Markov model，profile HMM）的方法對保守蛋白進一步比較，發(fā)現(xiàn)不同家族之間的ICE的重組和接合轉移模塊也具有保守特征。進而，針對ICE整合模塊和接合轉移模塊收集和建立profile HMM數(shù)據(jù)集，尤其對與接合轉移相關的IV型分泌系統(tǒng)（T4SS）進行重點挖掘，在531株已測序細