肺炎克雷伯菌和假單胞菌耐藥機(jī)制研究.pdf

1、1.目的：
　　肺炎克雷伯菌和假單胞菌均是臨床上常見的院內(nèi)感染菌,均為呼吸道感染的主要病原菌。目前這兩種菌種的臨床分離率不斷增加,耐藥情況日趨嚴(yán)重,臨床治療也十分棘手。本研究的目的在于了解汕頭地區(qū)肺炎克雷伯菌和假單胞菌的耐藥情況及耐藥機(jī)制,為臨床合理應(yīng)用抗生素提供理論依據(jù)。
　　2.方法：
　　2.1收集產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶肺炎克雷伯菌共74株,藥敏試驗(yàn)了解其耐藥情況,設(shè)計(jì)合成整合酶、I型整合子可變區(qū)的上下游引物,煮沸

2、法提取細(xì)菌總DNA作為模板,整合子可變區(qū)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化、克隆后測序,所得序列翻譯后在Genbank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對分析。
　　2.2收集耐亞胺培南的銅綠假單胞菌,設(shè)計(jì)合成銅綠假單胞菌外膜蛋白OprD2、IMP、VIM和SPM型獲得性金屬酶、PSE酶的上下游引物,煮沸法提取細(xì)菌總DNA作為模板,PCR技術(shù)篩選OprD2、獲得性金屬酶和PSE酶基因陽性菌株。
　　2.3選取同一病人治療前后臨床分離株,隨即擴(kuò)增多態(tài)性DNA對菌株

3、進(jìn)行基因分型,選取同源性菌株,頭孢西丁三相試驗(yàn)和頭孢西丁誘導(dǎo)試驗(yàn)檢測AmpC酶產(chǎn)生情況。
　　2.4對臨床上分離的一株對β-內(nèi)酰胺類抗生素高度耐藥的熒光假單胞菌,微量稀釋法測定對多種抗生素的MIC,堿裂解法提取質(zhì)粒DNA,金屬酶及I型整合酶引物擴(kuò)增產(chǎn)物純化測序。
　　3.結(jié)果：
　　3.1產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶肺炎克雷伯菌多為多重耐藥株,其中69株IntI1基因陽性,未發(fā)現(xiàn)IntI2和IntI3基因。菌株1型整合子可變區(qū)

4、包含11種不同的基因盒組合,共有13種不同的基因盒。Dfr和aadA基因盒最多見, DfrA12-orfF-aadA是最常見的基因盒組合,未發(fā)現(xiàn)編碼ESBLs的基因盒。
　　3.2耐亞胺培南銅綠假單胞菌僅對頭孢哌酮/三唑巴坦有較高敏感率,未發(fā)現(xiàn)產(chǎn)金屬酶株。共有6株菌株產(chǎn)PSE酶。大多數(shù)菌株存在OprD2基因突變。
　　3.3抗生素治療前菌株多產(chǎn)誘導(dǎo)高產(chǎn) AmpC酶,抗生素治療后,頭孢他啶對菌株的MIC明顯上升,菌株變成持續(xù)高

5、產(chǎn)AmpC酶株。
　　3.4菌株對包括碳青霉烯類抗生素在內(nèi)的β-內(nèi)酰胺類抗生素高度耐藥,對環(huán)丙沙星敏感,金屬酶試驗(yàn)陽性,金屬酶編碼基因位于 I型整合子上,該整合子位于一個(gè)大小為20kb左右的質(zhì)粒上,部分測序結(jié)果表明與IMP-8的氨基酸序列完全相同。
　　4.結(jié)論：
　　4.1整合子在產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌的多重耐藥中起重要作用,但與ESBLs的產(chǎn)生和播散無關(guān)。
　　4.2頭孢哌酮/三唑巴坦可作為耐亞胺培南銅綠假