耐氨基糖苷類銅綠假單胞菌的分子耐藥機(jī)制研究.pdf

1、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa，Pae)是院內(nèi)感染的主要病原菌之一。在中國重癥監(jiān)護(hù)病房分離的革蘭陰性菌中，銅綠假單胞菌位列第一。由于具有天然和獲得性耐藥，銅綠假單胞菌對(duì)很多抗菌藥物耐藥，給臨床治療帶來很大困難。Β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、喹諾酮類抗菌藥物是臨床治療Pae感染的常用藥，近年來隨著新的耐藥基因的不斷出現(xiàn)，Pae對(duì)這三類抗菌藥物的耐藥性普遍增加，甚至出現(xiàn)多藥耐藥（MDR）和泛耐藥（PDR）菌株。

2、>　　 因氨基糖苷類抗生素抗菌譜廣、療效卓越，在醫(yī)學(xué)臨床和畜牧獸醫(yī)業(yè)應(yīng)用廣泛,但由于濫用和過度使用氨基糖苷類藥物的耐藥問題隨之凸現(xiàn)，細(xì)菌對(duì)該類藥物耐藥是因?yàn)榧?xì)菌產(chǎn)生氨基糖苷類修飾酶(AMEs)、16SrRNA甲基化酶和氨基糖苷類抗生素作用靶位16S rRNA基因突變而致。氨基糖苷類修飾酶按功能可分成乙酰轉(zhuǎn)移酶（AAC）、磷酸轉(zhuǎn)移酶（APH）、核苷轉(zhuǎn)移酶（ANT）三類，分別修飾氨基糖苷藥物相應(yīng)位置上的-OH和-NH2，降低或喪失其對(duì)靶位

3、核糖體的親和力。編碼AMEs的基因起源于抗生素產(chǎn)生菌，該類基因所表達(dá)的酶在抗生素產(chǎn)生菌中起到自我保護(hù)作用，許多研究表明抗藥性產(chǎn)生菌所存在的自我保護(hù)機(jī)制與臨床耐藥菌的耐藥機(jī)制相同。
　　 整合子是一個(gè)能夠通過自身編碼的整合酶來獲取保外游離基因或基因片段并使之表達(dá)的遺傳元件系統(tǒng)。整合子既可位于細(xì)菌染色體上,又可位于質(zhì)粒上,還可位于轉(zhuǎn)座子上。對(duì)細(xì)菌抗生素耐藥機(jī)制的研究，導(dǎo)致了包括轉(zhuǎn)座子和共軛質(zhì)粒在內(nèi)的許多移動(dòng)元件的發(fā)現(xiàn)，而通過對(duì)這些元

4、件序列進(jìn)行比較分析后，最終發(fā)現(xiàn)了整合子的存在。
　　 研究目的：
　　 銅綠假單胞菌是院內(nèi)感染的主要條件致病菌之一，可引起嚴(yán)重的院內(nèi)獲得性感染。本研究試圖了解臨床常用的七種抗生素對(duì)60株銅綠假單胞菌（30株分離自門診病人，30株分離自住院病人）的抗菌活性和多黏菌素B與其它六種抗菌藥物(慶大霉素、奈替米星、阿米卡星、妥布霉素、環(huán)丙沙星、亞胺培南)體外聯(lián)合抗菌效應(yīng)，以及各種抗菌藥物對(duì)不同標(biāo)本來源菌株的抗菌效應(yīng)有無差別；了解氨

5、基糖苷類耐藥相關(guān)基因和16SrRNA甲基化酶基因存在情況以及菌株之間的親緣性；另外通過對(duì)臨床分離的銅綠假單胞菌的耐藥特征進(jìn)行分析、檢測(cè)相關(guān)耐藥基因和整合子攜帶情況等，初步探討銅綠假單胞菌對(duì)臨床常用抗菌藥物的分子耐藥機(jī)制，從而了解不同的耐藥機(jī)制間相互作用規(guī)律以及耐藥基因在菌株間水平傳播的特點(diǎn)，為臨床用藥提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)和幫助。
　　 研究方法：
　　 1、藥敏試驗(yàn)和聯(lián)合藥敏試驗(yàn)
　　 60株銅綠假單胞菌均來自廣州醫(yī)學(xué)

6、院第一附屬醫(yī)院的臨床標(biāo)本，對(duì)這些菌株采用瓊脂稀釋法測(cè)定7種臨床常用抗生素的最低抑菌濃度（Minimal inhibitory concentration,MIC）和藥敏情況，分析銅綠假單胞菌對(duì)這些抗生素的藥物敏感性；同時(shí)檢測(cè)多粘菌素B與其它6種藥物的聯(lián)合藥敏情況，分析它們之間的聯(lián)合藥敏情況，試圖開辟治療Pae感染新的途徑，在用藥選擇、降低用藥量和毒副作用方面起到一定作用。
　　 2、多藥耐藥銅綠假單胞菌氨基糖苷類修飾酶和16Sr

7、RNA甲基化酶基因分析
　　 針對(duì)臨床分離的Pae菌株，采用聚合酶鏈反應(yīng)分析氨基糖苷類修飾酶、16SrRNA甲基化酶基因型及其它基因型，運(yùn)用SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)菌株樣本親緣性做聚類分析。
　　 3、整合子的鑒定與分析
　　 利用PCR方法，通過擴(kuò)增整合子恒定區(qū)的方法，篩選攜帶整合子的菌株，并利用限制性片段多態(tài)性性（RFLP）酶切分析的方法對(duì)這些整合子進(jìn)行分類；對(duì)整合子恒定區(qū)擴(kuò)增陽性的菌株進(jìn)行測(cè)序和序列分析。探討

8、整合子攜帶的耐藥基因盒是否介導(dǎo)銅綠假單胞菌的多重耐藥。
　　 研究結(jié)果：
　　 1、銅綠假單胞菌對(duì)三類六種抗生素耐藥率普遍較高，分別為奈替米星68.3％、妥布霉素65.0％、慶大霉素60.0％、環(huán)丙沙星46.7％、亞氨培南40.0％、阿米卡星13.3％，而多黏菌素B的耐藥率為0；這些菌株中多重耐藥和泛耐藥菌的檢出率分別為55.0％（33/60）和31.7％（19/60）。多黏菌素B與環(huán)丙沙星、亞氨培南有明顯聯(lián)合抗菌效應(yīng)，

9、多黏菌素B與奈替米星聯(lián)合，能明顯降低彼此的MICG。各種抗生素對(duì)住院病例分離菌株和門診病例分離菌株，在MICG和差異顯著性方面表現(xiàn)各不相同。
　　 2、21株氨基糖苷類耐藥菌株中（其中20株為多藥耐藥菌株），氨基糖苷類耐藥基因型aac(6,)-Ⅰ陽性13株（61.9％）、aac(6,)-Ⅱ陽性13株（61.9％）、ant(2,,)-Ⅰ陽性10株（47.6％）、ant(3,,)-Ⅰ陽性9株（42.9％）、aac(3)-Ⅱ陽性的有1

10、株（4.8％），另有1株菌oprD2基因缺失，未檢出基因型aac(6,)-Ⅰae、aph(3,)-Ⅲ、aac(6,)-aph(2,,)和ant(4,)-Ⅰ；16SrRNA甲基化酶基因rmtA基因型陽性19株（90.4％）、armA基因型陽性有8株（38.1％），未檢出基因型rmtC、rmtD。聚類分析結(jié)果顯示分離的菌株中存在克隆傳播。
　　 3、30株臨床分離銅綠假單胞菌中16株（53.3％）整合子恒定區(qū)和可變區(qū)擴(kuò)增陽性，片段長

11、度在0.7-4kb之間。共檢出5種不同的整合子組合形式，含有編碼對(duì)氨基糖苷類、β-內(nèi)酰胺類和喹喏酮類抗菌藥耐藥的基因,其中有2例為新型基因盒組合形式，包括aacA4-VIM2和aadA2-OXA10-aacA4-blaIMP9-aatI1，Genbank基因庫登陸號(hào)分別為GQ890658和GU122165，另外3例分別與Genbank基因庫登錄號(hào)為FJ917747、FJ817423、GU367339的序列吻合。
　　 4、I類整

12、合子3′-末端qacEΔ1-sul1和intI1類整合酶基因的陽性率和陽性菌株相同。
　　 結(jié)論：
　　 1、臨床檢出的銅綠假單胞菌對(duì)常用抗生素多表現(xiàn)為多重耐藥。多黏菌素B單用有很好的抗銅綠假單胞菌效果，與環(huán)丙沙星（喹諾酮類）、亞氨培南（β-內(nèi)酰胺類）聯(lián)合應(yīng)用也有明顯的聯(lián)合抗菌效應(yīng)。對(duì)多藥耐藥和泛耐藥菌株，為減少用藥量和毒副作用，提高抗菌效果，可考慮多黏菌素B與這些抗生素聯(lián)合用藥。
　　 2、大部分測(cè)試的銅綠假單

13、胞菌對(duì)臨床常用的銅綠假單胞菌抗感染藥物已產(chǎn)生廣泛耐藥，尤其對(duì)氨基糖苷類抗生素。這些菌株的氨基糖苷類修飾酶常見耐藥基因型檢出率高，16SrRNA甲基化酶基因型rmtA和armA的檢出率亦較高。30株測(cè)試菌株中存在克隆傳播。
　　 3、本研究中攜帶intI1類整合子的16株P(guān)ae對(duì)氨基糖苷類全部耐藥，對(duì)喹喏酮類耐藥的有13株，對(duì)亞氨培南耐藥的有10株，對(duì)所有三類抗生素全部耐藥的有8株占50％，說明目前引起Pae耐藥的機(jī)制中，整合子耐